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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
 Inserito il - 22 giugno 2005 : 15:13:52
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PREMESSA: per vedere QUANDO e DOVE viene espresso un certo gene X posso creare organismi (nel mio caso drosophile) transgeniche, contenenti il costrutto (promotore di X)---(gene reporter es. GFP)
DOMANDA: perche' per far esprimere un certo gene Y sotto il controllo di un promotore che voglio io (es B) non posso semplicemente creare una mosca che contenga il costrutto (promotore B)---(gene Y)??
Per usare il metodo UAS Gal4 devo creare 2 mosche transgeniche, incrociarle tra loro e guardare chi, tra tutta la progenie, possiede entrambi i costrutti... invece facendo con il primo metodo mi basterebbe creare 1 sola mosca transgenica!
Oppure non ho capito qualcosa di fondamentale??
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 16:02:25
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Perchè non sempre i geni che ti interessano hanno un fenotipo facilmente evidenziabile. Non è più semplice contare delle drosophile verdi, piuttosto che andare a cercare dei fenotipi che magari non si possono osservare (come quelli comportamentali, ehi non mi vengono dei buoni esempi...:))?
Inoltre in questo modo si possono anche confrontare esperimenti diversi: se il promotore X fa diventare le Drosophile più verdi del promotore Y, allora X è più forte di Y, indipendentemente dalla funzione. Ho risp giusto? iHasta luego!
p.s. povere drosophile! Ho sentito parlare di veri e propri massacri.. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 16:19:00
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Contare le drosophile verdi di sicuro e' piu' facile che contare quelle che, per esempio, non vedono la luce blu.. ma non era questo il mio problema..
La premessa serviva solo per dire che so per certo che in Drosophila e' relativamente facile creare animali transgenici contenenti costrutti formati da promotore--gene, e che questo si fa per esempio per vedere dove e' espresso un certo gene (in effetti la premessa era alquanto inutile, scusa!!).
Quello che non riesco a capire e' perche', se voglio far esprimere un gene in un certo tessuto (diverso da quello in cui viene espresso nel wt), si usa il metodo UAS Gal4, mentre sarebbe secondo me molto piu' semplice e veloce realizzare mosche con promotore-gene...
ESEMPIO. Voglio far esprimere il fotorecettore CRY nelle zampe (CRY di solito e' espresso solo negli ocelli):
-io realizzerei un costrutto (promotore di gene espress solo nelle zampe)---(CRY) e con questo farei una mosca transgenica
-metodo UAS-Gal4: si realizzano due mosche transgeniche con due costrutti diversi:
1 (promotore di gene espress solo nelle zampe)---Gal4
2 (UAS)---(CRY)
(UAS e' la sequenza promotoriale riconosciuta da Gal4)
Poi si incrocia la linea 1 con la linea 2 e si seleziona la progenie con entrambi i costrutti.. in queste mosche CRY e' espresso solo quando e' attivo il promotore del gene delle zampe...
Ma allora non si fa prima con il primo metodo???
spero di essere stata piu' chiara.. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 17:32:06
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In generale direi che si può fare benissimo come dici tu; forse nel caso specifico UAS è un promotore più forte di quello della zampa e quindi è stato scelto di farlo in quel modo, o per qualche problema tecnico non era possibile fare il costrutto come dici tu.
Nel mio lab hanno fatto un topo transgenico con lacZ sotto il controllo di un promotore espresso in un particolare tipo neuronale, quindi direi che la cosa funziona (perlomeno nel topo, non so se la Drosophila abbia qualcosa di strano!).
nICO
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 17:45:34
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Quello che non capisco e' perche' in drosophila si usa il metodo "diretto" per vedere dove e' espresso un gene di interesse (quindi vuol dire che questo si PUO' fare!!)ma x guidare l'espressione di altri geni si usa il metodo gal4 UAS ("indiretto")...
In un articolo che ho trovato dicono che il metodo "bipartito" e' vantaggio perche', nella linea parentale, le proteine di cui voglio guidare l'espressione non vengono espresse.. quindi posso usare anche proteine tossiche o proapoptotiche...
Questo secondo me non spiega un bel niente.. se sto usando una proteina tossica per drosophila, che vantaggio c'e' ad avere una mosca con il gene di questa proteina..che pero' non viene espressa???
O tutti i drosophilisti sono pazzi, o c'e' qualcosa che ci sfugge...
Grazie lo stesso... se trovo una spiegazione plausibile vi faro' sapere.. ciao ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 18:15:05
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In effetti non ci avevo pensato!
Pensa di esprimere una proteina che per qualche motivo rende sterile la Drosophila o la fa morire poco dopo la nascita.
Crei il tuo costrutto ti sbatti un sacco per fare le Drosophile transgeniche e poi... muoiono tutte! Con il risultato che devi rifare tutto da capo.
Invece avendo le 2 linee con i 2 geni separati queste sono assolutamente normali (come fenotipo, perlomeno) e quindi per avere le Drosophile mutate ti basta incrociare le 2 linee parentali (e qui fanno tutto loro di solito... non devi fare fatica!)
Per le proteine non letali invece si potrebbe usare il metodo diretto.
Ciao
nICO |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2005 : 18:21:55
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Si... ma a cosa mi servono le linee parentali VIVE e TRANSGENICHE che non esprimono niente??
Le incrocio, e poi la progenie MUORE subito dopo la nascita (in questo esempio)
Allora cosa me ne faccio dei genitori? Ho creato 2 mosche transgeniche per niente
... tanto vale creare 1 linea transgenica sola.. cosi' vedo subito se le mosche muoiono o no...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2005 : 08:53:25
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La progenie magari non muore subito, potrebbe avere qualche strano fenotipo o ad es. essere sterile (ed è come se morisse dal punto di vista riproduttivo) o magari muore subito e vai ad analizzare qualche malformazione.
Le linee parentali ti servono proprio perchè sono vive e le puoi usare come riserva per generare quelle che servono a te.
Ora, non ho la più pallida idea di quanto tempo serva per ottenere una Drosophila transgenica, però supponiamo che ci vogliano 2 mesi (conta che x un topo si parla di almeno 1 anno): fai l'esperimento e la progenie muore o non si riproduce. Fai tutte le tue belle considerazioni e poi vuoi rifare l'esperimento per avere una conferma.
Devi sprecare altri 2 mesi per rigenerare i transgenici (con in più il fatto che non sei certa di farli nello stesso esatto modo). Invece avendo le linee parentali basta incrociarle e in tempi molto più brevi avrai la progenie transgenica.
nICO
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2005 : 18:18:12
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..ora ho le idee decisamente piu' chiare...
Grazie mille.. ciao ciao
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Marcus
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
1 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2005 : 12:45:23
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Il fatto di utilizzare il sistema indiretto GAL4-UAS fondamentalmente ti serve per essere sicura di ottenere il 100% delle cellule che hanno il tuo costrutto transgenico. Se inseriamo in una drosofila (tieni presente che queste modifiche si fanno sempre in stadi molto precoci dello sviluppo, spesso in cellule che non sono ancora andate incontro a differenziamento) il costrutto di nostro interesse (UAS-transgene-Neo, Neo:resistenza alla neomicina), questo andrà a inserirsi per ricombinazione omologa, o illegittima, all'interno del genoma.. non di tutte le cellule purtroppo. Tieni presente che c'è sempre un fattore statistico di mezzo. Delle cellule che hanno inglobato l'oligo dovremmo avere un modo per poterle riconoscere (ad esempio inserendo la resistenza alla Neomicina). Dopodichè quando le cellule che hanno inglobato l'oligo si differenzieranno, ce ne sarà una parte che andrà a formare la linea germinale. Lo stesso facciamo con le drosofile dell'altro sesso (TSP-GAL4-Neo, TSP: promotore tessuto specifico). Anche qui le cellule che hanno inglobato l'oligo si differenzieranno e alcune andranno a svilupare la linea germinale. Ora, nel momento in cui fai incrociare le due linee di drosofila otterrai una progeine F1 che conterranno entrambi i costrutti... ma avrai la certezza che tutte le cellule li conterranno! dopodichè avendo inserito un promotore tessuto specifico potrai far esprimere il tuo trangene solo nel tessuto nel quale ti interessa farlo esprimere.. e volendo, grazie all'ausilio di particolari induttori, decidere anche in quale preciso stadio dello sviluppo farlo esprimere!
La presenza del gene che conferisce la resistenza alla Neomicina è necessaria per distinguere le cellule che hanno inglobato l'oligo.. la parte in cui modifichi le cellule avviene in vitro.. e solo dopo che avrai ottenuto le tue cellule modificate potrai impiantarle in una drosofila.
Questo fondamentalmente è quello che si fa con i topolini.. non so fino a che punto possa valere anche per le drosofile. Spero di essere stato in parte chiaro..e di non aver scritto fandonie! bye! |
Zion is the law |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2005 : 13:47:48
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Certo.. e grazie infinite |
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peter8f
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 12:43:54
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non può essere semplicemente perchè GAL4 puo' essere espresso in maniera tessuto specifica?
quindi nel tuo caso gal 4 verrà prodotta solo nelle zampe, solo qui, quindi potrà legare UAS e solo qui quindi avrai l'espressione del tuo transgene.
che ne pensi? |
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pasqualep.
Nuovo Arrivato
Prov.: NA
Città: C/MARE DI STABIA
12 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2012 : 11:31:04
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il motivo è che se tu fai esprimere gal4 in maniera tessuto specifica, ti sei creato un ceppo che potrai usare sempre... nel senso: scopri che questo sistema tsp-gal4 è stato utile a farti esprimere il gene x sotto uas in neuroni ok? Se adesso vuoi vedere un altro gene nei neuroni cosa ti fa avvenire puoi prendere lo stesso ceppo che ti esprime gal4 sotto promotore dei neuroni ed incrociarlo con un altro uas- gene Y. E in più d'altra parte una volta che ti sei creato un ceppo uas geneX lo puoi incrociare con tanti tsp diversi che portano gal4 in altri tessuti specifici... es uas GFP è quello generico. Con promotore neuron specifico + gal 4 vedi l'espressione nei neuroni, con un ceppo promotore occhio specifico vedi la gfp nell'occhio... Ti sei costruito una libreria stabile che puoi incrociare a tuo piacimento senza dover creare tanti ceppi diversi ...
spero di esser stato chiaro! |
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UAS Gal4
