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Eziad
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983
Prov.: Napoli
Città: Napoli


36 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2007 : 21:59:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eziad Invia a Eziad un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
vorrei qualche informazione su come cambiare i cicli di una PCR quando ottengo delle bande con molti aspecifici?? grazie

Eziad

valefarfa
Nuovo Arrivato

Prov.: Teramo
Città: Teramo


24 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2007 : 00:00:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valefarfa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valefarfa Invia a valefarfa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quello che devi fare è cambiare la temperatura di annealing dei primers.. probabilmente è troppo bassa affinche l'appaiamento sia specifico.. ti consiglierei di fare un gradiente, ovvero di provare, se hai il termociclatore adatto, ad aumentare solo la temperatura di annealing nei vari pozzetti dell'apparecchio, cosa che ti farà risparmiare tempo e fatica.. se così non dovesse funzionare allora rivedrei la sequenza dei primer e magari proverei a cambiarli..
spero di essere stato chiaro, altrimenti nn ti fare problemi a chiedere.. ciao
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2007 : 00:30:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
è giusto quello che dice valefarfa, quando hai degli aspecifici non devi cambiare i cicli, ma devi cambiare la temepratura di annealing.
I cicli si cambiano (abbassando) solo se hai una enorme quantità di prodotto specifico ed una quantità modesta di aspecifico

La temperatura in genere si alza quando hai troppo aspecifico...
oppure potresti aggiungere un po' di DMSO 0,5% fino a 5% alla reazione di PCR

tutto dipende dal rapporto specifico/aspecifico
e se l'aspecifico abbia un peso molecolare più alto o più basso

etc etc

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vladimiro
Nuovo Arrivato




3 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2007 : 01:27:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di vladimiro Invia a vladimiro un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
premesso che quanto scritto sopra sono le variabili sicuramente più importanti da controllare ...io in casi estremi proverei a cambiare anche la concentrazione del magnesio e a controllare la purezza del dna che hai posto nella pcr ...non si a mai.

ciao


più si sà e meno si conosce
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Eziad
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983

Prov.: Napoli
Città: Napoli


36 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2007 : 18:39:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eziad Invia a Eziad un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie millevolevo una ulteriore delucidazione: di quanti gradi devo cambiare la temperatura di annealing....
grazie mille per la vostra disponibilità

Eziad
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Eziad
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983

Prov.: Napoli
Città: Napoli


36 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2007 : 19:34:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eziad Invia a Eziad un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

ciao neuroscienze il mio aspecifico ha un peso molecolare più basso rispetto al gene d'interesse, quindi come devo fare?
GRAZIE

Eziad
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valefarfa
Nuovo Arrivato

Prov.: Teramo
Città: Teramo


24 Messaggi

Inserito il - 26 novembre 2007 : 12:17:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valefarfa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valefarfa Invia a valefarfa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao eziad, dovresti provare ad alzare la temperatura di annealing di 0,5 1 °C alla volta... certo che se hai, come ho già detto, una t-gradient, saresti molto più avvantaggiata...
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Eziad
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983

Prov.: Napoli
Città: Napoli


36 Messaggi

Inserito il - 27 novembre 2007 : 13:18:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eziad Invia a Eziad un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie

Eziad
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