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cristiano
Nuovo Arrivato


Prov.: Novara
Cittā: novara


37 Messaggi

Inserito il - 26 novembre 2007 : 11:38:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cristiano Invia a cristiano un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, mi trovo ad affrontare un problema: attualmente dispongo di una libreria di cDNA, creata in fasmidi, del tipo pBluescript. Questi fasmidi infettano Coli, formando delle placche su agar, esprimono la proteina codificata dal cDNA e posono essere quindi essere utilizzati per la sua individuazione. Queste librerie sono gia` state testate, ma siccome la proteina, che era sconosciuta, non ha risposto a nessun anticorpo, non si e` piu` andati oltre. Ora, dato che anche la sequenza genica e` sconosciuta, non si riesce a lavorare ne` con sonde ne` in PCR. Attualmente sono riuscito, basandomi sulle omologie interspecifiche, a trovare una piccola zona semi-conservata, sulla quale ho disegnato un primer che potrebbe annilarsi. Cio` che mi era venuto in mente di provare era di utilizzare questo mio primer in combinazione con un altro specifico per il plasmide utilizzato nella libreria (i classici T7 o M13), per vedere di ottenere qualche prodotto da mandare a sequenziare. I discorso e`: in che modo? Come la screeno questa libreria? Faccio 2000 PCR su ogni placca per vedere se ne viene fuori qualcosa? Non c'e` un modo piu` breve? Grazie!

CRI

Balsamo del Canadā
Nuovo Arrivato

E. coli

Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Cittā: Verbania


97 Messaggi

Inserito il - 26 novembre 2007 : 17:48:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Balsamo del Canadā Invia a Balsamo del Canadā un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao cristiano, per ridurre il numero delle PCR da fare puoi fare in questo modo. Bisognerebbe avere la tua liberia ancora in soluzione, prima di trasformare E.coli. A questo punto il tuo volume lo aliquoti e lo disponi in una matrice (tipo 10x10)..in modo che ogni pozzetto abbia una aliquota della tua libreria. A questo punto al posto di fare 100 PCR singole si generano delle miscele in questo modo: una per ogni riga e una per ogni colonna. Le fai mescolando per ogni riga un decimo di ogni pozzetto (di quella riga) e allo stesso modo per le colonne.
Quando fai la PCR praticamente testi una riga e una colonna intere alla volta. Per sapere da quale pozzetto viene il risultato positivo semplicemente controlli le intersezioni tra le righe e le colonne positive. Cosė ora al posto di 100PCR ne hai fatte 20. Il pozzetto positivo puoi ora suddividerlo di nuovo in matrice...
E' tutto chiaro? E' una cosa un pō complicata da spiegare non a voce!

-B.del C.-
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