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Discussione |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
 Inserito il - 02 dicembre 2007 : 18:05:40
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Salve a tutti,
mi chiamo Francesco e sono nuovo qui, quindi non so se questo è il luogo giusto per porre domande, cmq ho un problemino che spero qualcuno possa aiutarmi a risolvere: devo effettuare una serie di Real Time utilizzando un Taq della Takara (una HotGoldStar) ma le reazioni risultano essere estremamente inefficenti, qualcuno che abbia già lavorato con questa Taq saprebbe darmi qualche consiglio? Grazie in anticipo.
Francesco
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 00:33:00
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| Puoi provare ad abbassare un po' la T di annealing e magari giocare un po' con le concentrazioni di primer, Mg, o template. |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 07:49:35
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Grazie chick80, questa in effetti è la strada che stò tentando da un pò di tempo, ma speravo ci fosse qualcosa che non avevo considerato, ad esempio sai dirmi se e quanto sarebbe utile l'utilizzo di BSA e DMSO?
Grazie! |
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 13:12:16
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Ciao Francesco, scusa ma mi chiedevo che intendi per reazioni inefficienti? qual'è il problema che riscontri? |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 13:49:46
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Forse ci dovresti spiegare meglio che tipo di problemino hai..
...se non hai neanche amplificazione del controllo (che tu avrai saggiamente pensato)....uno dei tanti problemi può essere l'attività della polimerasi.
Hai mai usato altre polimerasi?
_______________________________________________
Una cosa da non sottovalutare nella hotGoldStar è che se non la scaldi a 95°x10' non parte...
Important :
Add 10 minutes pre PCR cycle at 95C to the end user normal PCR program to activate the enzyme. No amplification will be observed without this prior cycle.
___________________________________
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 14:05:54
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| Il plot dell'amplificazione mostra un andamento tutt'altro che esponenziale,la crescita è quasi lineare (che dici pubblico?), sono arrivato fino al 70° ciclo,il che è quasi illegale per una real time PCR, senza andare a plateau... |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 14:48:39
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Se non hai avuto amplificazione neanche nel contollo positivo allora:
Qualcosa è andato storto! Ricontrolla le condizioni.
Stai attento alla temperatura di attivazione della taq: novantacinque gradi per dieci minuti.
Questo step lo fai?
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 16:09:07
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Aureus ti ringrazio per il link al data-sheet, lo avevo ma questo mi ha dato qualche spunto in più (o forse l'ho solo letto con più attenzione). Forse mi stò avvicinando un poco alla soluzione: i campioni sui quali devo lavorare hanno un bassisimo grado di purificazione quindi nell'ultima prova ho aumentato la quantità di Taq ed ho avuto un netto miglioramento sia nel Takeoff che nell'andamento del plot.
Quanto al controllo positivo, dovendo testare software, strumento, reagenti e metodo di estrazione, non mi è possibile utilizzarne uno.
Grazie ancora a tutti per i preziosi suggerimenti, vi terrò aggiornati! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 20:53:33
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Beh, ma proprio perchè devi testare tutte queste cose un controllo positivo è assolutamente un must!
Domanda banale: hai provato a usare le stesse condizioni di concentrazione e temperature in una PCR tradizionale? Può essere un buon modo per ottenere un set di condizioni di partenza.
Per quanto riguarda BSA e DMSO o anche PEG se non erro... non li ho mai usati, ma ho sentito che funzionino! (però non garantisco) |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2007 : 10:55:42
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| chick80 credo tu abbia ragione in effetti un controllo che dia una buona reazione mi permetterebbe di eliminare tutte le variabili lasciando solo quelle relative alla reazione specifica...mi attivo immediatamente,grazie!! |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2007 : 12:58:38
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Purtroppo anche i controlli interni danno gli stessi problemi, comincerò dal principio rivedendo il metodo di estrazione del DNA.
Grazie a tutti! |
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