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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 02 dicembre 2007 : 21:36:13
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Salve a tutti, è la prima volta che scrivo in questo forum e spero di trovare in questa sede delle risposte capaci di chiarire i miei attuali dubbi riguardanti la Tm del prodotto di amplificazione in una reazione di qPCR.
Mi spiego meglio, durante una reazione di PCR real time è fondamentale effettuare l'analisi della curva di melting per valutare la specificità di amplificazione la possibile presenza dei dimeri di primer e così via, la cosa che mi chiedo è questa:
Visto che in genere una reazione di real time PCR viene condotta in triplicato,quale è la differenza tollerabile dela Tm di ciascun replicato che va ad identificare lo stesso prodotto; es.: se il mio prodotto in un replicato ha una Tm di 79.5; nell'altro replicato 80 e nell'altro ancora 81, si tratterà sempre dello stesso amplicone?
spero di aver spiegato bene la situazione
grazie mille 
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valefarfa
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Teramo
24 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 17:27:56
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| dunque dunque... per la precisione la curva di melting è fondamentale per una Real Time solo quando usi intercalanti (SYBR Green).. utilizzando la curva di melting si è quasi sicuri di escludere aspecifici e per quanto riguarda il range di tollerabilità non dovresti avere grossi problemi perchè se ti si dovesse formare un aspecifico, la probabilità che il frammento abbia la temperatura di melting circa uguale a quella del tuo amplificato è molto bassa.. accontentati di un range di variabilità di 0,5 °C circa.. ciao! |
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curva di melting
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