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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2007 : 19:34:34
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ciao, ho bisogno di un aiuto...oggi ho fatto un'immunofluorescenza per titolare degli anticorpi che dovrò utilizzare in seguito, ho seguito il protocollo che ho sempre utilizzato in tutte le immunofluorescenze fatte in precedenza per evidenziare proteine citoplasmatiche: ho fissato le cellule con PFA 2%, le ho permeabilizzate con PBS Triton 0,5 %, ho diluito entrambi gli anticorpi in PBS latte 5%, ho controcolorato i nuclei con ioduro di propidio e tutti i lavaggi li ho fatti con PBS.
Quando sono andata a guardarli non sono riuscita a vedere nulla o meglio solo deboli segnali e bruttissimi per i nuclei. Ho guardato il vetrino in luce bianca e ho notato che le mie cellule erano praticamente disgregate. Ho ipotizzato che ci fosse stato un problema nella permeabilizzazione, infatti ho utilizzato una soluzione di PBS/triton che avevo preparato la settimana scorsa e volevo sapere se secondo voi può essere quello il problema. Vi chiedo anche come preparate la PFA (io la preparo 4%, aliquoto, conservo a -20°C e scongelo solo quella che uso, la diluisco in PBS e se l'avanzo la butto). Misurate il pH quando la preparate? la diluite in PBS? a quanto scaldate la soluzione per scioglierla?
Grazie in anticipo!!!
ciao a tutti
Eleo
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2007 : 21:17:21
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In lab da noi la PFA si prepara fresca ogni volta, ma che io sappia si può anche tenere nel -20.
Io rimisurerei il pH ogni volta comunque.
Se le cellule sono disgregate magari potresti usare meno Triton (0.1%?), oppure diminuire il tempo di permeabilizzazione.
Citazione:
io la preparo 4%, aliquoto, conservo a -20°C e scongelo solo quella che uso, la diluisco in PBS e se l'avanzo la butto
mi raccomando quando butti la PFA di farlo nell'apposito contenitore (che spero esista) per i rifiuti speciali, non nel lavandino! |
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