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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2007 : 20:01:31
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...dopo il problema dell'immunofluorescenza ho un altro "problema" da porvi...da pochissimo sto imparando a fare gel bidimensionali su proteine estratte da tessuto congelato...ho preparato tutti i miei campioni senza alcun problema, tuttavia uno di essi ha una concentrazione di proteine totali troppo bassa (il tessuto da cui partivo era meno rispetto a tutti gli altri campioni) quindi mi è stato detto di provare a precipitare le proteine con TCA, risospenderle in un volume inferiore, rifare il dosaggio e eventualmente solo in caso negativo ripartire dal tessuto. Ho un paio di protocolli per la precipitazione con TCA, abbastanza diversi fra loro e la scelta che ho fatto è stata dettata da motivi di tempo e basta. Qualcuno può darmi informazioni un po' dettagliate su come fare questa precipitazione e la resa...?
Altra cosa...oggi ho preparato la soluzione di TCA 100% a partire dalla polvere, ho notato però che la polvere in realtà era "trasformata" in cristalli galleggianti in acqua...quello che chiedo è, innanzitutto, se è una cosa normale,poi, se come penso non è una cosa normale, la soluzione che ho preparato può funzionare ugualmente?
grazie 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2007 : 21:18:35
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Per la soluzione non credo sia un problema. Non ho mai lavorato con il TCA ma immagino sia abbastanza igroscopico, è per quello che ti si formano i cristalli. Se lo riesci a dissolvere, ad ogni modo, non ci dovrebbero essere problemi. Al massimo guarda se l'MSDS del TCA dice qualcosa a riguardo.
Per il protocollo, puoi provare a guardare su Protocol Online, ce ne sono diversi. Facci sapere se ne trovi uno che funziona!  |
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2007 : 22:08:07
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| Non conosco la precipitazione con TCA, ma so che quando io avevo la proteina troppo diluita la concentravo tramite l'Amicon(R), un apparecchio munito di filtro che con l'aiuto di magnete girante e pressione elevata faceva ridurre il volume della soluzione e di conseguenza aumentava la concentrazione della proteina... Magari può esserti utile. A seconda di quanto devi concentrare la proteina, il processo può richiedere da mezz'ora a 3-4 ore. |
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rosagna
Nuovo Arrivato
Prov.: Salerno
Città: salerno
1 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2008 : 13:08:20
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Prepara una soluzione di TCA al 12%, 1.5 ml in una provetta eppendorf da 2 ml, versa goccia a goccia, aiutandoti con un pipettatore, 100 ul della tua sospensione proteica. metti a 4°C per 30', centrifuga per 20 min a 12.000 rpm, allontana il TCA, prosegui con dei lavaggi (ca. 3) del pellet con acetone freddo ponendo in congelatore il tutto per 20' prima di centrifugare.
ovviamente i volumi sono indicativi regolati sulla quantità di campione che devi precipitare.
p.s.
al termine dei lavaggi allontana l'acetone e lascia asciugare il pellet per circa 15' (se prolunghi questo tempo potresti risospenderlo molto difficilmente) risospendilo quindi nel tampone da te utilizzato, potresti avere bisogno di sonicare un po' il campione o vortexare molto |
PhD Di Pasqua Rosangela
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2008 : 21:23:57
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Grazie a tutti, avevo risolto utilizzando un protocollo fornito da protocol on line molto molto simile a quello consigliato da "rosagna" e non ho avuto nessun problema. Grazie a tutti
ciao |
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