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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2007 : 13:33:34
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Salve a tutti, vi è mai capitato che in una reazione di qPCR il 18S uscisse al 28 ciclo quindi di gran lunga dopo del gene di interesse?
quale potrebbe essere la causa??
grazie a tutti
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2007 : 23:40:34
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Strano... la prima cosa che penserei è di aver messo per errore una [] troppo bassa di primers per il 18S.
In questi casi la cosa migliore è fare un altra PCR con gli stessi campioni. Se funziona bene, ti puoi dimenticare di quel risultato strano, se non funziona allora puoi cominciare a pensare a cosa possa essere andato storto
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2007 : 11:56:07
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grazie chick, ma ho fatto già un'altra PCR ed i risultati sono sempre strani...
la conc di primer da me uti,izzata è 200nM, quindi non penso sia troppo bassa, la conc di RT invece 50ng...
adesso sto rifacendo un ulteriore esperimento con 100ng di templato, provo ad abbassare i cicli, sperando non mi si abbassino troppo quelli del campione...
grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2007 : 20:29:25
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No, io quando dicevo concentrazione più bassa intendevo quelle situazioni tipo: dovevo pipettare 5 ul e ne ho pipettati 0.5ul perchè in quel momento qualcuno mi ha distratto! 
Però se hai già rifatto la PCR il problema non è quello...
Immagino tu stia facendo la PCR in duplex: hai già usato questa combinazione di primers (18S + il tuo gene)? Cosa succede se fai una PCR solo per il 18S? I due primers potrebbero competere in qualche modo strano. |
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2007 : 16:36:07
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ciao chick, non sto facendo una duplex, le reazioni di amplificazione del 18S e del mio gene sono separate...
non so se il trattamento che faccio alle cellule può andare ad influenzare l'espressione del 18S, quindi la vitalità cellulare, per questo motivo magari cambio housekeeping, che dici?? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2007 : 21:40:13
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Sì, forse in quel caso conviene cambiare housekeeping....
Ma il problema ce l'hai anche nei controlli? (non trattati intendo)
PS: perchè non fai una duplex? |
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