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kakybiotech
Nuovo Arrivato


Prov.: Macerata
Città: Camerino


21 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2007 : 14:42:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kakybiotech Invia a kakybiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,
vorrei chiedervi una mano per quanto riguarda la possibilità di reperire dei protocolli già utilizzati e dei suggerimenti per ilclonaggio del mio gene di interesse in un vettore di espressione contenente la GFP...
GRAZIE

Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2007 : 13:48:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Ciao io per clonare i miei geni di interesse in vettori di clonaggio con GFP o dei Tag utilizzo la tecnologia Gateway dell'invitrogen.
Altrimenti devi fare una cosa più artigianale con le ligasi..
..ora non ho il mio computer con me ma alcuni protocolli ce li ho.
Intanto guardare il Topocloning GW8 chè è un sistema Gateway che sfrutta le topoisomerasi per clonare il tuo prodotto di PCR all'entry clone.
Potrbbe esserti utile


Ciao.

-Lorenzo

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2007 : 14:23:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quoto Lorenzo, anch'io ho sempre usato Gateway e Topo Cloning per fare i miei vettori!
Se devi iniziare ti consiglio di partire a fare l'entry vector con TOPO che è più facile e poi passi al vettore di espressione con Gateway. Sul sito dell'Invitrogen trovi tutto.

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kakybiotech
Nuovo Arrivato


Prov.: Macerata
Città: Camerino


21 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2007 : 21:47:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kakybiotech Invia a kakybiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille ad entrambi, i vostri consigli mi sono veramante utili anche a te Lorenzo se potessi consultare i tuoi protocolli ti sarei infinitamente grato
a presto

-Carmen-
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 18 dicembre 2007 : 20:26:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per EGFP intendi che deve essere espresso a parte oppure devi fare delle proteine chimeriche?

Se intendi la seconda ci sono dei vettori appositi, si chiamano EGFP-C1, EGFP-C2, EGFP-C3 per clonaggi al C-terminale di EGFP nei tre frame di lettura ed i vettori EGFP-N1, EGFP-N2 e EGFP-N3 per i clonaggi alll'N-terminale.

sono commerciali ma li trovi anche in diversi laboratori, le mappe le trovi su internet.

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Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 19 dicembre 2007 : 12:28:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
_______________________________
Karybiotek Says:
"Grazie mille ad entrambi, i vostri consigli mi sono veramante utili anche a te Lorenzo se potessi consultare i tuoi protocolli ti sarei infinitamente grato
a presto"
____________________________________

TAPPE PRINCIPALI DI UN CLONAGGIO GENICO

-Disegnare i Primers con siti di restrizione opportuni per il clonaggio da effettuare (es. OLIGO).
Amplificare mediante PCR la sequenza genomica di interesse.
-Controllare l'amplificato su minigel di Agarosio.
-Purificare il prodotto di PCR per il clonaggio:
1.Eluizione da gel di Agarosio (Jetsorb, resine varie, freeze-squeeze ecc.).
2.Purificazione e concentrazione tramite filtri. Kit
-Digerire gli inserti con enzimi di restrizione scelti per il clonaggio (10ul volume di digestione, 1 ul enzime).
-Purificare il frammento digerito con microcon, meglio che con Jetsorb.
-Plasmidi: Si preparano delle midipreps per ottenere una buona resa di plasmide. Esso viene digerito con enzimi scelti come siti di clonaggio e purificato dopo digestione .
LIGATION
Si prepara un minigel di agarosio sul quale si caricano plasmide linearizzato purificato e inserto da clonare digerito e purificato per valutare le CONCENTRAZIONI relative.
Correlare le concentrazioni del DNA-Double Strand con l' analisi spettrofotometrica.
Il rapporto vettore :inserto dovrebbe essere 3:1, ma consideranconsiderando che il plasmide linearizzato è circa 3 volte più lungo della sequenza da clonare, si scelgono quantità i(volumi in microlitri) dei d2 DNA comparabili (!;!).
-Volume di reazione 10 ul, di cui:

DNA vettore Calcola

DNAinserto Calcola tu quanto

T4Ligasi 1ul

Buffer Ligation 10x 1ul

Acqua sterile Fino a Volume 10ul


Controlli: Sono costituiti dalla ligation effettuata sul vettore in assenza di inserto.
La quantità di DNA plasmidico dei controlli deve essere uguale a quella impiegata nei campioni.
-Incubare O.N. a 16°C oppure a 4-5 ore a R.T.
-Screenare il nuovo plasmide utilizzando prima le digestioni poi il sequenziamento.
-Le ligation si usano inizialmente per trasfettare batteri competenti mediante elettroporazione.

P.S.
Già sai come lavorare in queste tecniche in Ghiaccio per preservare gli enzimi compreso la ligasi.

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
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Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2008 : 10:48:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse tu intendevi i protocolli del gateway??

http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pcr8gwtopo_man.pdf

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
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