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dabar
Nuovo Arrivato
Prov.: Catania
Città: Catania
30 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2007 : 23:44:57
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Ciao Ragazzi,
ho un problema con la purificazione di una banda da gel di agarosio...dopo avere purificato da un gel tre bande di cDNA, rappresentanti probabilmente 3 diverse isoforme trascrizionali, facendo una nested avrei dovuto ottenere (quanto meno dalla prima e dalla terza banda) amplimeri diversi, invece per tutte e tre le bande ottengo sempre uno stesso amplimero, atteso per la prima delle tre bande!!!!
...Che durante il ritaglio delle bande possa esserci stata contaminazione ci può stare, ma che non ottengo completamente l'amplimero atteso per la terza banda????!!!!!!!!
...Aiutatemi per favore!
Grazie e a presto.
dabar
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 23 dicembre 2007 : 21:42:33
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| Anche a me sono venuti in mente subito i primer. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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turok
Nuovo Arrivato
Prov.: Siracusa
Città: Siracusa
47 Messaggi |
Inserito il - 29 dicembre 2007 : 16:22:18
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Secondo il mio umilissimo giudizio, potrebbe essere probabile che all'interno della sequenza del cDNA appartenente alla prima delle tre diverse bande su gel di agarosio sono presenti sequenze che combaciano circa con le sequenze presenti alle estremità 3' e 5' dei cDNA facenti parte della seconda e terza banda del gel di agarosio; in tal modo può accadere che i primers depuati ad annealarsi (scusate il termine inglese italianizzato) con le estremità del cDNA della seconda e terza banda, vadano ad annealare con le sequenze interne del cDNA della prima banda (che, se non erro, dovrebbbe essere quello più lungo dei 3 cDNA e allora contenente un maggior numero di nucleotidi che daranno quindi una maggiore probabilità di ritrovare le sequenze presenti all'estremità 3' e 5' degli altri 2 cDNA).
spero di averti aiutato a risolvere una parte del dubbio.
Ciao  e
  W LA SCIENZA!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! |
Non è perchè le cose sono difficili che non osiamo, ma è perchè non osiamo che le cose sono difficili.
Seneca.
è più facile spezzare un atomo che un pregiudizio.
Albert Einstein. |
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turok
Nuovo Arrivato
Prov.: Siracusa
Città: Siracusa
47 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 13:54:58
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ciao davide, ho visto che sei di catania, beh forse c conosciamo, visto
che io sn di siracusa ma sn a catania per università ed altro.
Cmq, tornando a noi. Rileggendo ciò ke mi hai scritto, ho pensato ke potrebbe trattarsi di un "falso positivo", mi scuso per l'uso del termine che potrebbe sviarti, ma mi spiego subito:
1) quando hai usato una coppia di primers che distinguesse (sulla base dei diversi PM) 2 delle 4 isoforme del gene in esame, potrebbe essersi verificato un annealing aspecifico, che infatti ti ha dato la comparsa di parekkie bande presenti tra le uniche 2 attese (cioé la long di 2 kb e la short di 1.6 kb);
2) potrebbe anke trattarsi, come ti ho precedentemente detto, che all'interno dell'isoforma long del tuo gene, sia contenuta una ripetizione, se pur parziale, della sequenza complementare alla tua coppia di primers.
Nel caso 1) posso consigliarti, come tu saprai di certo, di modificare un parametro della pcr (un parametro tra i seguenti: temperatura di annealing (per aumentare la specificità di legame dei primers);
quantità di taq polimerasi (nel caso la taq da te utilizzata non disponga della processività richiesta per amplificare il frammento in esame);
tempo finale di riscaldamento a 72ºC (nel caso la taq abbia copiato parzialmente i tuoi frammenti oligonucleotidici; in questo caso, prolungando il tempo di annealing finale, la taq continuerà a copiare i frammenti incompleti fino al loro ultimo nucleotide) (potresti cambiare anke la quantità di primers, ma questo lo hai già fatto).).
P.S.: RICORDATI DI CAMBIARE UN PARAMETRO PER VOLTA.
Nel caso 2) posso consigliarti di disegnare nuovamente i tuoi primers, ma con una sequenza nucleotidica più lunga (questa soluzione non è la migliore, ma è l'unica che mi è venuta al momento), oppure disegnare dei primers ke si leghino a delle regioni contigue alle regioni in cui si legavano i tuoi primers iniziali (in questo caso amplificherai frammenti più lunghi comprendenti, oltre il tuo gene, anke delle regioni contigue di nucleotidi).
Spero di essere stato chiaro.
In caso ci vedremo a catania, io mi chiamo Salvo. Ciao. |
Non è perchè le cose sono difficili che non osiamo, ma è perchè non osiamo che le cose sono difficili.
Seneca.
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Albert Einstein. |
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geigerin
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: pisa
6 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 15:03:57
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Ciao tutti! sto studiando le varie varienti della PCR e mi sono imbattuta nella
nested PCR, ma non capisco a cosa possa servire... |
zuikuk |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 15:16:39
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Io la usavo per aumentare la specificita' della reazionedi PCR...
Nel caso di questo topic veniva usata per discriminare 3 diverse isoforme trascrizionali che nel gel migravano tutte alla stessa velocita'!
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geigerin
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: pisa
6 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 15:19:42
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Grazie... |
zuikuk |
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NESTED PCR
Didattica e Relazioni
