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amfidea
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


15 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 14:44:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amfidea Invia a amfidea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, sono nei casini perchè devo fare una tesina e non sono abile ad usare gli strumenti informatici, mi dareste una mano per favore? Devo estrapolare la sequenza di interesse e digerirla con gli enzimi di restrizione. HELP ME PLEASE!!!

Studiare una strategia per

- amplificare il gene codificante per l'enzima alanine dehydrogenase di Mycobacterium tuberculosis a partire da DNA genomico

- sottoclonare il suddetto gene in un vettore d'espressione tale per cui la proteina ricombinante corrispondente espressa in E. coli sia dotata di His-tag N-terminale

Suggerire inoltre un protocollo di purificazione all'omogeneità della proteina ricombinante ed un saggio per verificarne l'attività enzimatica (qui è necessario che si legga almeno un articolo sulla caratterizzazione biochimica dell'enzima).

Per recuperare la sequenza amminoacidica dal sito www.ncbi.nlm.nih.gov, le ricordo di selezionare "protein" nel menu a scomparsa dopo la scritta "search" prima di inserire il nome della proteina d'interesse nella finestra a fianco. Una volta entrata nel file cerchi la scritta "CDS" che corrisponde alla sequenza di DNA codificante la proteina, necessaria per il disegno dei primer e per l'analisi di restrizione virtuale (che può fare al sito http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) .

Per recuperare le sequenze di un vettore del tipo suddetto (serie pET expression vector) le consiglio di consultare la lista di quelli disponibili al sito http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pETTable.html


Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 19:45:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premettendo che non ho mai fatto una cosa del genere, con NCBI posso darti qualche aiuto...
Puoi trovare:
PROTEINA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&id=44566
CODING SEQUENCE
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=44565&from=76&to=1197&view=gbwithparts
Articolo sulla misura dell'attività dell'alanina deidrogenasi di Mycobacterium
http://www.biochemj.org/bj/343/0669/3430669.pdf

Questi sono i comments per l'AlaDH di S. Aureus su Swissprot per la funzione della proteina:
Citazione:
Comments

* FUNCTION: May play a role in cell wall synthesis as L-alanine is an important constituent of the peptidoglycan layer (By similarity).
* CATALYTIC ACTIVITY: L-alanine + H2O + NAD+ = pyruvate + NH3 + NADH.
* PATHWAY: Amino-acid degradation; L-alanine degradation via dehydrogenase pathway; NH(3) and pyruvate from L-alanine: step 1/1.
* SIMILARITY: Belongs to the AlaDH/PNT family.



Comunque secondo me sia per fare la PCR sia per clonare il gene nel vettore devi prendere una porzione più ampia della sola CDS, cioè non puoi partire dall'atg iniziale secondo me...Magari riesci ad amplificarlo il gene, ma poi i siti di restrizione ti cadono dentro la sequenza codificante...su NCBI ci sta nel GenBank nella finestra un parametro che si chiama Range...Prova a cambiare da lì la lunghezza della sequenza da prendere...

Edit:
I vettori su quel sito che hanno l'His-tag sono:
pET-45b(+)
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB396.pdf
pET-46 Ek/LIC
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB397.pdf

Il secondo però fa uso di un kit...Praticamente ti forniscono i primer per fare la PCR e il clonaggio avviene tramite il loro kit, non con i passaggi di digestione e ligation...Quindi se devi disegnare i primer secondo me ti conviene prendere il primo, tanto l'MCS ha parecchi siti di restrizione...Sono tutti e due sotto il controllo del promoter T7 e hanno il sito di clivaggio per l'enterochinasi per il recupero della proteina di tuo interesse...



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MirrorHole
Nuovo Arrivato

Il Professore



14 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 21:01:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MirrorHole Invia a MirrorHole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Schuldiner86
Comunque secondo me sia per fare la PCR sia per clonare il gene nel vettore devi prendere una porzione più ampia della sola CDS, cioè non puoi partire dall'atg iniziale secondo me...Magari riesci ad amplificarlo il gene, ma poi i siti di restrizione ti cadono dentro la sequenza codificante...su NCBI ci sta nel GenBank nella finestra un parametro che si chiama Range...Prova a cambiare da lì la lunghezza della sequenza da prendere...


Ciao a tutti sono nuovo del forum!
Giustissimo!...ma secondo me non seve amplificare una regione più ampia da DNA genomico! Basterebbe disegnare dei primers con delle estremità 5' protruding contenenti i siti di restrizione che intendi utilizzare in seguito per il clonaggio nel plasmide consigliato da Schuldiner86!
Ciao

...accendere una candela è gettare un'ombra...
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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 21:07:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da MirrorHole
Ciao a tutti sono nuovo del forum!
Giustissimo!...ma secondo me non seve amplificare una regione più ampia da DNA genomico! Basterebbe disegnare dei primers con delle estremità 5' protruding contenenti i siti di restrizione che intendi utilizzare in seguito per il clonaggio nel plasmide consigliato da Schuldiner86!
Ciao


Giustissimo non ci avevo pensato! Grandissimo!



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valme83
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 23:51:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valme83 Invia a valme83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono d'accordissimo con entrambi, soltanto assicurati che ci sia un promotore sul plasmide a monte del sito di clonaggio..altrimenti, se non c'è, basta che ti allarghi un pochino sul genoma quando decidi la sequenza da analizzare, basta anche solo a monte, in modo da amplificare insieme anche il promotore endogeno..
Poi ricordati, quando scegli l'enzima di restrizione da usare, che devi prima controllare che non tagli all'interno del gene e di tutta la regione che vuoi clonare!
Ciao ciao
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valme83
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2008 : 23:57:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valme83 Invia a valme83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah scusa, non mi ero accorta che quelli consigliati sono già vettori di espressione, quindi dal punto di vista del promotore stai già a posto :)
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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 05 gennaio 2008 : 10:46:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si, il gene clonato è sotto la regolazione del promoter dell'operone lac...



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amfidea
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


15 Messaggi

Inserito il - 07 gennaio 2008 : 09:43:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amfidea Invia a amfidea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi occorrono i primers con delle estremità 5'protruding contenenti i siti di restrizione per l'analisi di restrizione virtuale da fare con la sequenza che trovate su : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/v...ew=gbwithparts e il vettore d'espressione che trovate su :
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB396.pdf

L'analisi di restrizione virtuale va fatta sul sito http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

Avrei bisogno la sequenza dei primers e i siti di restrizione che hai usato per il sottoclonaggio...io non sono pratica nell'usare gli strumenti informatici ed è la prima volta che tratto questa materia.
Ora provo a cimentarmici io, ma sarei grata se mi daste modo di confrontare il mio operato.
grazie a tt i collaboratori !

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amfidea
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


15 Messaggi

Inserito il - 07 gennaio 2008 : 10:11:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amfidea Invia a amfidea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho trovato 105 enzimi di restrizione tra gli 0 cutters(endonucleasi che non tagliano all'interno del frammento d'interesse), quali devo usare? E' indifferente?
Fatemi un esempio voi!
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MirrorHole
Nuovo Arrivato

Il Professore



14 Messaggi

Inserito il - 07 gennaio 2008 : 15:56:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MirrorHole Invia a MirrorHole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da amfidea

Ho trovato 105 enzimi di restrizione tra gli 0 cutters(endonucleasi che non tagliano all'interno del frammento d'interesse), quali devo usare? E' indifferente?
Fatemi un esempio voi!


Ciao!
Non è indifferente!
Per disegnare i primers con i 5' protruding dovresti usare quei siti di restrizione che NON siano presenti all'interno del tuo frammento (0 cutters), ma che SIANO PRESENTI,invece, all'interno dell'MCS del plasmide di espressione che intendi utilizzare!
Per esempio nel tuo caso credo che potresti utilizzare BsrGI e NotI così eviti anche che il plasmide ed il tuo inserto si richiudano su se stessi!
Spero di esserti stato di aiuto!
Ciao

...accendere una candela è gettare un'ombra...
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