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Autore

Discussione

daisy
Nuovo Arrivato

Prov.: Asti
Citt�: asti

108 Messaggi

Inserito il - 09 gennaio 2008 : 17:50:57

ciao a tutti non ho tanto capito il meccanismo della produzione di proteine ricombinanti. Esse servono per non degradare proteine eterologhe e purificarle unendole con una proteina stabile dell'organismo ospite. Allora i cDNA son tra loro fusi. Prendo un vettore plasmidico che abbia un promotore regolabile e forte e determino una sequenza che codifica per proteine batteriche , scegliendo nel frattempo anche un cDNA di interesse , e individuando nel plasmide il sito polilinker. Il mio problema sta nel fatto che non riesco a capire il passagio alla proteina ricombinante: la prof ha detto che si clona il cDNA davanti al DNA di interesse e poi si combinano a livello del sito multiplo di clonaggio in modo tale che la proteina pu� associarsi in 3'ovvero in C- terminale o in 5' ovvero N-terminale. Ma tutto si riduce a questo ? un altro problema consiste nel trovare da proteine fuse la sequenza della proteina ricombinante. Ce l'ho capita cos� prendo una p-MAl proteina sensibile al maltosio che presenta un promotore inducibile e un MBP(Maltose biding protein)poi isolo la proteina fusa dal vettore di espressione e la faccio passare in una colonna con resina a cui � legato maltoso . Le proteine sensibli si legano al maltoso e dopo eluizione si ottengono proteine di fusione purificate. La prof ha aggiunto che se aggiungo molto substrato ovvero maltoso i miei rilevamenti sono pi� accurati nella purificazione. Ho capito male

? Mi potete aiutare a risolvere questi dubbi? grazie

e@daisy

nyo84
Utente Junior

Prov.: Brescia
Citt�: Piancogno

239 Messaggi

Inserito il - 10 gennaio 2008 : 14:42:54

le proteine di fusione si ottengono creando un plasmide che contiene una seq di un gene per una proteina seguita da un'altra seq di un'altra proteina. il vettore deve essere un vettore d'espressione. in questo modo,quando inserisci il plasmide nell'ospite,questo tradurr� la tua nuova sequenza e otterrai una proteina di fusione..il fatto di essere legato al 5' o al 3' dipende dall'ordine delle seq nel plasmide. poi si possono fare varie cose nella costruzione della nuova seq come ad es inserire un linker tra le due proteine...questa tecnica � ad es usata nel phage display dove si creano delle prot di fusione tra una proteina di membrana del fago e un anticorpo in modo che poi il fago esponga al suo esterno l'anticorpo che poi selezioni facendo reagire con l'antigene di interesse..
il metodo che ha spiegato la tua prof per la purificazione � uno dei tsnti metodi che ci sono..� corretto perch� la prot di fusione creata ha una parte che lega maltosio,quindi facendo una cromatografia d'affinit� riesci a trattenere nella colonna le proteine di fusione. poi fai eluire ed ottieni una frazione di proteina di fusione purificata. � logico che se nella colonna leghi pi� residui di maltosio,c'� pi� probabilit� di legare le proteine di fusione..
se hai ancora qualcosa da chiedere,chiedi pure..

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