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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
 Inserito il - 10 gennaio 2008 : 12:26:59
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CIAO AMICI...tempo fa facemmo un laboratorio dove cn colorazione EE SI Colorava un frammento di fegato di topo...ho trovato il protocollo...solo che parte dalala sparaffinatura in poi...dando x scontato il meccansimoper estrarre tagliare e purificare il fegatino...aiutoo...me lo descrivete come se doveste farlo a un bambino incapace.
GRAZIE MILLE
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 19:52:40
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Tagliare con il bisturi il frammento che vuoi esaminare.
1) Immergere nella la formalina tamponata al 10%( per fissare) il tempo dipende dallo spessore del campione , considera che il potere di penetrazione della formalina è 0,8 mm/h.
2) Disidratazione con una scala ascendente di alcool etilico fino all’assoluto.
I tessuti sono privati dell’acqua
3) Chiarificazione o diafanizzazione mediante xilolo o sostituti
4) Infiltrazione della paraffina 3 cambi(è allo stato liquido perchè scaldata a circa 58-60 C°)
5) Inclusione cioè viene orientato il frammento su una base (formazione blocchetto, la paraffina si solidifica raffredandosi)
6) Taglio sezione di 2-3 micron per mezzo del microtomo (la fetta viene adesa al vetrino)
7) Asciugare la sezione in stufa
8) Colorazione con ematossilina- eosina
I tempi e il numero dei passaggi dei reagenti dal punto 2 al punto 4 ora non li ricordo perchè sono passaggi automatizzati fatti da uno strumento che si chiama processatore.
Domani mattina vado a vedere i tempi e poi te li scrivo
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 21:37:39
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| cacchio è perfetto graziegrazie...xkè proprio nn lo ricordavo e verrà chiesto...l altra e ultima domanda sulla pratica è la volante con blu ditoluene...dimmi anche questa e sei il mio idol(a)o ihihih grazie cri |
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 21:55:08
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unica cosa nn chiara:
io taglioil frammento di fegato cn bisturi, ma non dovrebbe autodigerirsi?
inoltrecome faccio a immergerlo?cn pinzette?diretto?lo miscelo cn qualcosa?scusa ma sn proprio un negato |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 23:16:55
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La formalina NON va toccata con le mani. Sempre usare i guanti e se ci devi mettere dentro qualcosa usare delle pinzette o una spatolina.
L'immersione è generalmente diretta se hai fatto in precedenza una perfusione dell'animale con PF. Altrimenti potrebbe essere utile sciacquarlo prima in PBS. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 23:28:44
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No il fegato non si autodigerisce, è il pancreas il peggiore e devi processarlo in pochissimo tempo.
Per immergerli in genere si utilizzano delle cassette da inclusione tipo queste:
Per quanto riguarda i tempi io ho questa vecchia metodica manuale:
FISSAZIONE: FORMALINA 10% 1 notte
DISIDRATAZIONE:
- ALCOOL 70% 1 ora
- ALCOOL 80% 1 ora
- ALCOOL 100% 1 ora 30' (2 cambi)
DIAFANIZZAZIONE: BIOCLEAR 1 ora (2 cambi)
IMPREGNAZIONE: PARAFFINA 1 ora + 1 notte (2 cambi)
Tieni conto da un laboratorio all'altro possono variare leggermente
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2008 : 13:01:18
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Ma cosa intendi con volante? Significa che devi colorare una sezione eseguita al criostato? Volevi dire blu di toluidina ?
Se ti colleghi al sito dei tecnici d'istologia AITIC troverai di tutto di più riguardo l'stologia ( ci sono anche numerose colorazioni tra cui anche quella con blu di toluidina in leggi il libro di laboratorio)
http://www.cadelora.it/index.php?q=node
I tempi di processazione dove lavoro io sono i seguenti (considera che sono tempi medi che vanno bene sia per frammenti di mm2X 2 (biopsie) che frammenti di dimensioni maggiori ( la massima dimensione è data dalle dimensioni interne della cassettina d'inclusione )
- ALCOOL 70% 1 ora
- ALCOOL 80% 1 ora
- ALCOOL 95% 1 ora
- ALCOOL 95% 1 ora
- ALCOOL 100% 1 ora
- ALCOOL 100% 1 ora
- ALCOOL 100% 1 ora
- Xilolo 1 ora
-Xilolo 1 ora
-Xilolo 1 ora
_-Paraffina 1 ora e 30'
-Paraffina 1 ora e 30'
-Paraffina 1 ora e 30'
INCLUSIONE
Se non perfondi il topo dopo aver tagliato il pezzo che ti interessa immergi il piu velocemente possibile in formalina così blocchi gli enzimi autolitici ( lavora sotto cappa poichè la formaldeide è tossica). La cancerogenicità è stata accertata sui roditori (per la specie umana non ci sono ancora dati) dove la formaldeide provoca un tasso di incidenza di cancro al naso ed alla gola superiori al normale.
Il volume di formalina da mettere nel tuo contenitore deve essere ALMENO 10 volte di più del volume del tuo campione. Mentre il tempo di fix ottimale dipende dallo spessore del campione come ti ho già detto il potere di penetrazione della formalina è 0,8 mm/h. Comunque un buon tempo MEDIO (che va bene sia per biopsie che frammenti maggiori sono 24 ore)
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2008 : 19:30:28
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grazie era blu di toluidina...x volante credo intendesse un vetrino veloce x verifcare se andava bene quello che avevi fatto.
grazie dell aiuto |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 19:37:53
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GRAZIE DELL AIUTO...HO TROVAATO UN VEKKIO PROTOCOLLO DELLA PROF...QUCOSA NN MI TORNA FORSE ESSENDO SCRITTO AMANO LO HAN MAL RICOPIATO...controllatelo please
per controllare steatosi:uso ematox-eosina...emat è basica evidenzia nucleo acido
e eos acida evid citopl basico
fasi:
1)prelievo
2)fissazione con formalina
3)sparaffinatura, adesione taglio con microtomo 1 micron
4)idratazione:
H2O fonte 5 min
5)colorare con ematox 8 min
6)h2o x5 min
7)3 lavaggi veloci h20 dist
8)eosina 30 sec
9)h2o dist veloce
10)disidratazione scala da alcool 95 in giù
11)chiarificazione montagio
non mi sembra lo stesso ordinevosto...oson io che sbaglio son negato enn ricordo niente...menomale che vale poko il laboratorio o almeno dovrebbe eheheh(a volte non vien nemmeno chiesto) |
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 20:29:44
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NO l'ordine giusto è il seguente parola di tecnico d'istologia
per controllare steatosi :uso ematox-eosina...emat è basica evidenzia nucleo acido
e eos acida evid citopl basico OK!!!
fasi:
1)prelievo
2)fissazione con formalina
(secondo quello che scrivi tu passi dalla form.alla sparaffinatura ma cosa sparaffini??? ti manca un passaggio intermedio)
PROCESSAZIONE ED INCLUSIONE (vedi sopra)
TAGLIO ED ASCIUGATURA FETTE
3)sparaffinatura (CON XILOLO 3 cambi)
ALCOOL 100 (3 cambi) ALCOOL 95 (2 cambi)ALCOOL 70
4)idratazione:
H2O fonte 5 min
H2O distillata qualche minuto 2-3
5)colorare con ematox 8 min (ematossilina di Carazzi)
6)h2o DI FONTE x5 min (VIRA L'EMATOS)
7)3 lavaggi veloci h20 dist
8)eosina 30 sec (SE AGGIUNGI ALCUNE GOCCE DI ACIDO ACETICO PUOI RIDURRE IL TEMPO E VIENE UN COLORE PIU' BRILLANTE)
9)h2o dist veloce
10)disidratazione scala da alcool 95 ( IN SU CIOE' ALCCOOL 100 3 cambi)
11)chiarificazione (CON XILOLO 3 Cambi)
12) montaggio (CON EUKITT, la sezione viene racchiusa tra il vetrino e il coprioggetto). L'EUKITT fa da collante ed ha lo stesso indice di rifrazione del vetro.
Continua ad essermi oscura la tua domanda sul blu di toluidina. Questa colorazione può essere fatta sia sulla sezione paraffinata che su una sezione eseguita al congelatore in questa caso il tempo della colorazione è ridotto a pochi minuti in quanto non c'è la sparaffinatura nè l'idratazione (ma solo la col., disidratazione e montaggio).
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 20:38:40
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| perfetto tuttochiaro...a quanto ho trovato negli appunti quel blu serve per fare un vetrino volante cioè unaprovaveloce se quello che hai fatto è giusto cioè se tutte le procedure per la EE son state fatte bene con questo volante blu a microscopio dovresti veder in un attimo che hai fatto bene...grazie sei gentilissimo cmq!!! |
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 20:43:59
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| Non c'è di che ma I AM WOMAN |
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 20:47:55
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| yeah...allora grazie mille sei stata gentilissimA |
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 12:14:15
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| visita www.ic1trepuzzi.it sezione scuola media papa giovanni link laaboratorio scientifico |
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 15:10:47
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Suggerisco di inserire la metodica nella sezione
Protocolli di Laboratorio.
In questo modo si potrà aggiungere a quelle già presenti ed avere uno spazio unico e preciso in cui avere e raccogliere questo tipo di informazioni.
Grazie per la collaborazione,
Riccardo |
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Preparazione fegato topo
Didattica e Relazioni
