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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
 Inserito il - 21 gennaio 2008 : 14:25:33
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Salve...devo fare un'estrazione di RNA da biopsie di cute..il campione che mi danno dalla dermatologia consiste in un pezzo di 3mm di epidermide e derma..il problema è che nn riesco a romperlo..chi mi da qualche idea?
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Farah |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 17:06:59
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| hai provato con il potter? |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 17:12:54
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| Criofrantumazione?Se rompe le cellule vegetali... |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 19:33:06
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La criofrantumazione la usavo ank'io x le foglie (quando ero in tesi) ma c'è il problema dell'azoto liquido..ke dovrei fare un'indagine di mercato e vedere ki me lo "regala".
Ho provato con il sistema delle microbitz magnetiche..ma nulla...!
Domani mi metto alla ricerca di un potter o di un pestello negli archivi del laboratorio.  |
Farah |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 09:07:12
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Noi abbiamo triturato addirittura l'osso per poi estrarre l'RNA.Penso che non ci sia "tessuto" biologico più duro.
I pezzi che erano stati inizialmente congelati in azoto e conservati a -80°C sono stati rimessi in azoto, poi sono stati pestati (avendo cura di mantenere sempre un pò d'azoto all'interno del mortaio), infine messi nel buffer di lisi ( nel nostro caso il Qiazol della Qiagen), quindi potterizzati ed estratti.
E' molto importante mantenere il pezzo sempre in azoto, non basta il freddo del ghiaccio o del ghiaccio secco utilizzando il mortaio, perchè il tempo che passa per questo tipo di operazione è tanto, troppo per poter estrarre un buon RNA. Poi come dico sempre dipende da cosa ne devi fare di quell'RNA, se devi solamente dire se c'è o no ( come per i virus) non è che tu abbia bisogno di una buona qualità, ma se devi andare in Real o fare qualcos'altro di specifico è fondamentale avere dell'ottimo RNA e quindi ti consiglio di valutarne la qualità con il Bioanalyzer dell'Agilent ( ce n'è uno simile della Biorad). Altra cosa fondamentale è l'estrazione, vedi se c'è un kit dedicato al tuo tipo di tessuto. |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 09:09:00
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| Ah, dimenticavo, spesso i mortai si rompono con l'azoto, per cui fai attenzione e abbine uno o due di scorta. |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 16:44:42
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| Mi sa ke hai proprio ragione tu..oggi ho provato ad estrarre con il potter ma senza azoto liquido e l'RNA si è tutto degradato..la prox settimana mi attrezzo con l'azoto e magari faccio anke una prova in parallelo con il sonicatore..se mai troverò una sonda delle dimensioni giuste per la mia biopsia. |
Farah |
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Marina Prestia Lamberti
Nuovo Arrivato
Prov.: Vibo Valentia
Città: Vibo Valentia
1 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 17:05:25
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ciao Marianna ,noi abbiamo fatto estrazioni di RNA da tessuto mammario utilizzando semplicemente 1ml di triazol reagent (invitrogen)triturando il pezzo con un bisturi su piastre petri in ghiaggio.
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2008 : 14:42:09
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Citazione:
triturando il pezzo con un bisturi su piastre petri in ghiaggio.
E la qualità del tuo RNA ? Hai provato a vederlo?
Un metodo che stiamo utilizzando ultimamente che facilita molto, ma non te ne ho parlato perchè non è facile trovarlo e non è detto che per il tuo tessuto funzioni, è uno strumento della Qiagen che permette di triturare,omogenare i tuoi campioni mediante delle biglie. Si inseriscono delle biglie ( quante, di che dimensioni e per quanto tempo, devi stabilirlo tu facendo delle prove) nella provetta contenente il tuo liquido di lisi/conservazione e questa viene posta in uno "sbatacchiatore" ovvero un aggeggio che le agita. Per biopsie di endometrio, muscolo cardiaco, fegato e tessuto adiposo funziona benissimo.
Il vantaggio più grande con questo metodo è la numerosità dei campioni che riesci ad omogenare in pochissimo tempo, il che non è poco. |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2008 : 23:39:10
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| Caro Cin...lo strumento di cui mi parli è disponibile in uno dei laboratori del mio dipartimento..ma le provette con le biglie x ora mancano e si aspetta ke arrivino..ma se volessi usarlo quanto devono essere grandi i pezzi di biopsia? |
Farah |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2008 : 08:31:57
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Onestamente non penso che ci sia un minimo di grandezza definito, dovresti fare delle prove perchè dipende da tessuto a tessuto, per esempio il tessuto adiposo contiene di per se poco RNA rispetto a molti altri tessuti quindi ne devi mettere abbastanza sia che tu utilizzi il potterizzatore che le biglie.
Con il metodo delle biglie sono venuti benissimo dei campioni di biopsie di endometrio che per forza di cose non potevano essere una buona quantità, per cui non mi resta che augurarti in bocca al lupo e facci sapere com'è andata. |
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Discussione |
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Estrazione di RNA da tessuti
Didattica e Relazioni
