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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
 Inserito il - 22 gennaio 2008 : 20:17:58
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salve a tutti!
ragazzi aiutatemi...
non so più che fare.. sono alle prese con degli immunoprecipitati... sono venuti una volta e ora non vengono più!
ho provato a fare alcune prove ma pare che è il target a non venir giù... sui miei filtri vedo solo le catene dell'anticorpo..nient'altro....
come devo fareeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee
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titz |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 22 gennaio 2008 : 21:17:41
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può succedere di sbagliare in qualsiasi punto dell'immunoprecipitazione e ti giochi il target!
ad esempio, a me una volta è successo di dimenticare di mettere l'anticorpo per immunoprecipitare, oppure di usare un gel troppo concentrato in cui la mia proteina (era enorme) non scendeva!
se sei sicura di tutti i passaggi che fai, allora può dipendere anche da una concentrazione troppo bassa di proteine. quello che cmq ti consiglierei di fare è ti esporre con l'ecl plus e di lasciare in esposizione la lastra per parecchio tempo. il fatto che tu veda le catene non vuol dire niente, perchè danno un segnale fortissimo anche dopo molti stripping, sono le prime ad uscire.
che peso ha la proteina? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 21:28:25
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| Sei sicura che i campioni contengano il target? Corri anche gli estratti totali? Usi dei controlli positivi di IP? |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 11:42:17
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allora la proteina che devo buttare giù è di 110 kDa, per cui effettivamente è un po' grandina. Sono sicura che nell'estratto totale c'è perché l'ho trasfettata e la vedo quando corro i lisati totali.
Cmq, oggi sto provando a correre tutto su un gel al 10%.
Secondo me sbaglio qualcosa quando lavo gli IP... prima di caricare... voi come fate????
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titz |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 12:30:47
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Dopo aver tenuto gli eppendorf sulla ruota in camera fredda per 3-5 ore...
centrifuga 1 min a 2000-3000 nella centrifuga a freddo
4 volte (da fare in ghiaccio):
- togliere il sovranatante con ghilson, ATTENZIONE A NON TIRAR SU IL PELLET
- aggiungere 500 ul di Lisys buffer
- agitare leggermente per inversione
- centrifuga 1 min a 2000-3000 nella centrifuga a freddo
poi aspirare quasi tutto il sovranatante, ATTENZIONE A NON TIRAR SU IL PELLET. Aggiungere Laemly e bollire...
Questo è il mio protocollo...
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 13:43:19
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aspirare quasi tutto il surnatante....
cioè? quanto devo lasciare nell'eppendorf? 20ul vanno bene?
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titz |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2008 : 15:33:44
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in genere io mi regolo così: una volta che hai lisato le cellule e hai immunoprecipitato (io lascio andare la reazione O.N. a 4°C e in agitazione), centrifugo per 10' a 4°C, elimino il surnatante (aspiro tutto quello che non fa parte del pellet, il pellet anche se poco lo dovresti vedere bene) e il pellet che mi resta (che comprende la mia proteina target, l'anticorpo che ho usato per immunoprecipitare e l'A/G plus agarose) lo lavo 3 volte con lo stesso buffer che ho usato per lisare le cellule. anche questi lavaggi (di 5' ciascuno) li faccio in centrifuga refrigerata e in genere uso una quantità di buffer di 500 ul.
dopo l'ultima centrifugata elimino TUTTO (ti deve restare solo il pellet) aggiungo il sample buffer e faccio bollire 5 minuti, come ha detto domi.
cmq, per una proteina di 110 kDa il gel al 10% va benissimo, io l'ho usato a questa % per una proteina di 170 kDa ed è uscita senza problemi. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 11:24:52
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Se avete voglia potreste inserire il protocollo nell'apposita sezione!
ok, appena ho un attimo di tempo provo a scrivere qualcosa  |
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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 12:10:41
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strano ma vero..oggi si è fatto vedere il mio capo!
Gli ho parlato dei problemii con l'IP... e sapete che mi ha detto?
cambia il lysis buffer, perché se è contaminato i batteri che vi crescono producono proteasi che tagliano tutto...
Bene.
Rifatto il buffer, provo a fare come dice iside che mi sembra un buon metodo. E poi in questo modo le proteine precipitate sono più concentrate. Anche se, quando mi hanno insegnato l'immunoprecipitazione mi hanno detto: "Attenta a non caricare anche le beads, altrimenti vediamo solo strisciate".Per cui vi chiedo, voi usate questo tipo di attenzione?
Anyway, vi faccio sapere come viene l'esperimento del secolo (prrrrr! :P!)la settimana prossima.
Un'ultima domanda.
In che volume lisate le cellule? E quanto di questo lo utilizzate per l'IP?
Io liso in 200ul. Di questi, 180 li metto in un tubo nuovo con l'anticorpo e faccio andare ON a 4°C sul rotamix. Ma non aggiungo altro buffer.
Il giorno dopo aggiungo 1ml di lysis buffer incompleto, agito un attimo e spinno. Poi, scarico il surnatante (ma non tutto, rimangono nell'eppendorf qualcosa come 30-40ul)e aggiungo ancora 1ml di lysis buffer incompleto. Questi lavaggi li faccio per 3-4 volte, aggiungo il sample buffer e carico.
Tuttavia, ho l'impressione di diluire troppo il precipitato. Che ne pensate?????
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titz |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 12:28:48
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Citazione:
"Attenta a non caricare anche le beads, altrimenti vediamo solo strisciate".Per cui vi chiedo, voi usate questo tipo di attenzione?
Noi carichiamo con l'hamilton. Dopo che hai bollito il campione (e dato una spinnata) vedi che aspirando il campione c'è una parte superiore (che è quella che devi caricare) e una parte inferiore dove c'è la resina. Ovviamente meno ne prendi di resina, meglio è...ma a me non ha mai dato particolari fastidi...
Citazione:
In che volume lisate le cellule? E quanto di questo lo utilizzate per l'IP?
Io liso in 400 ul, ne tolgo 50 da dosare per i totali, e il resto li metto in un eppendorf, e aggiungo altri 400ul di lysis per fare volume, perchè (per come so io) se il volume è troppo poco, l'agitazione su ruota non viene tanto bene. Poi aggiungo resina e Ab e lascio sulla ruota a 4°C per 3-5 ore. |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 14:17:23
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quoto quello che ha detto domi
certo, può succedere di aspirare e caricare un po' di resina, quando versi il campione nel pozzetto, se hai preso resina te ne accorgi, ma neanche a me non ha mai dato grossi problemi.
se tieni l'eppendorf un po' inclinata e con il puntale ti appoggi alla parete dovresti riuscire a non prendere resina.
per rispondere all'altra domanda, io lavoro su cellule che crescono in aderenza, quindi prima ho bisogno di screparle in PBS e una volta raccolte e centrifugate, ci metto dentro 500 ul di buffer. questa quantità va bene per il n° di cellule che uso io per ogni esperimento, ma potrebbe non andare bene per te. una buona regola è usare un volume di lysis buffer 3 volte superiore al volume del pellet. poi, poichè la lisi la faccio durare 30', alla fine, se vedo cluster nell'eppendorf aggiungo altri 100 ul e agito fortissimo, ancora per 30'. dato che so già che le mie proteine sono tantissime, a me bastano 10 ul di lisato per fare il dosaggio. il resto lo uso tutto per immunoprecipitare (questo è il motivo per cui i miei anticorpi finiscono dopo 2 esperimenti  )
domi ha detto una cosa giusta, se il volume è troppo poco hai problemi non solo a lisare, ma anche ad immunoprecipitare e sinceramente 180 ul mi sembrano pochini (certo, dipende da quante cellule hai).
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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 16:07:24
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è così strano...
ho sempre pensato anch'io che fosse opportuno lisare in volumi maggiori ...
1. per diluire l'estratto totale che è sempre concentratissimo (noi lisiamo le cellule quando sono arrivate all'80% di confluenza più o meno.... )
2. per la reazione di immunoprecipitazione, effettivamente con volumi maggiori i tubi girano meglio..
mi vengono certi nervi se penso al tempo e al materiale che ho buttato...
cmq grazie a tutti, farò tesoro dei vostri preziosi consigli.
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titz |
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