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caso1986
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 Inserito il - 28 gennaio 2008 : 16:58:01
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CIAO RAGAZZI...sto studiando l elettroporazione...
a parte che non ho ben chiaro qualti milli secondi duri perchèp ho visto che nelle dispense dice 8-10 con certe cellule...45 con e coli...e qualche secondo?????con i protoplasti...
la mia domanda è, visto che non lo ho trovato...
UNA VOLTA CHE VOGLIO FARSI CHE STE CELLULE ASSUMANO IL DNA CON ELETTROPORAZIONE E QUINDI DEVO A QUANTO LEGGO INSERIRE UNA SOLUZIONE/SOSPENSIONE IN UNA CUVETTA CHE POI SARà SOGGETTA ALLA SCOSSA COME DEVO SOLERLE, SOSPENDERLE LE CELLULE CON IL DNA???
per spiegarmi meglio...
per fare la lisi alcalina prima bisogna mettere le cellule in LB AMP x 37 gradi e una notte in agitazione...poi si succhia fuori dalla coltura con pipetta e si procede...
qua come devo metterle le cellule nella cuvetta insieme al dna???con un tampone???
grazieeeeee
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Neuroscience
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 Inserito il - 28 gennaio 2008 : 19:08:12
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ma di che stai parlando?
cosa devi elettroporare? batteri? cellule? ceppo?
per i batteri è seplice, basta aggiungere il DNA alle cellule elettrocompetenti e poi scossa.
Per le cellule eucariotiche è un po' più difficile, ma il procedimento sostanzialmente è invariato. |
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caso1986
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Prov.: Bologna
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79 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 19:14:49
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a ok non devo inserire in una provetta con un tampone, basta che ci spruzzo dentro le cellule e il dna ???
cioè io sn zero di laboratori...faccio biologia per far il nutrizionista e ho anche quasi finito:-) perdona la mia ignoranza...volevo sapere come è composta la soluzione dna+cellule...come si preparano insomma le cellule da mettere nella cuvetta con il dna... |
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Neuroscience
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659 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 20:36:16
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Tecnicamente
1) scongeli le cellule elettrocompetenti in ghiaccio, circa 10'
2) pipetti 1-5 ul di DNA direttamente nell'eppendorf delle cellule
3) prendi le cellule e le versi nella celletta, meglio se fredda
4) metti la celletta con le cellule nell'apposito foro e premi un pulsante
5) recuperi la celletta e metti un po' di LB per recuperare le cellule batteriche
6) metti l'LB con i batteri in un falcon da 15 ml e fai crescere 1 h a 37°C
7) piastri il tutto su Agar+Antibiotico di selezione
8) lasci la piastra a 37°C per una notte.
9) il giorno dopo hai tante piccoli puntini sulla piastra, ognuno dei quali è una colonia batterica originata da un singolo batterio che ha integrato il DNA plasmidico, quante più colonie hai più cellule hanno preso il tuo DNA.
come si fanno le cellule elettrocompetenti
(esistono diversi protocollo e diverse variazioni)
1) prendi un batterio senza resistenza e lo fai crescere in 4 ml di lb per tutta la notte
2) versi i 4 ml in 400 ml di LB senza antibiotico
3) ogni tanto verifichi l'assorbimento a 600 nm e metti in tabella il rapporto tempo/assorbimento
4) quando arriva a 0,500-0,550 oppure al centro della crescita esponenziale, fermi tutto sommerso in ghiaccio in una camera fredda per 30 minuti
5) centrifughi a 4°C ed a bassa velocità poi butti il mezzo
6) risospendi in acqua e glicerolo 10% sterile
7) ricentrifughi 1-2 volte con nuovo glicerolo 10%
8) risospendi le cellule in 1,5 ml di glicerolo 10% e aliquoti in eppendorf, circa 90 ul, direttamente in ghiaccio secco + alcool
9) congeli a -80°C, e poi scongeli le aliquote che ti servono di volta in volta. |
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caso1986
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Prov.: Bologna
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 Inserito il - 28 gennaio 2008 : 20:39:57
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| volevo sapere proprio questo!graaazie |
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caso1986
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Inserito il - 28 gennaio 2008 : 20:48:41
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e èper quanto riguarda i paramentri?ho trovato un grafico utile che rapporta diametro cellulare a forza di campo sia per cellette da 2 mm che da 4 di diametro e con cellule con diametri cellulari in relazione alla scarica...
ma non ho trovato nulla sui tempi in millisec...
ho trovato che le cellule è bene siano al 50-75% della log e la densità sia da 1x10 alla sei a 3x10 alle 6 per ml...
niente sul tempo di scarica...
puoi aiutarmi?grazie |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 21:02:20
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il tempo di scarica è un valore variabile in funzione della conduttanza della soluzione dei batteri...
in pratica anche il DNA è elettricamente carico, quindi di conseguenza fa passare la corrente, con questo anche i sali in cui si svolge la ligasi etc.
Tutte queste cose potrebbero causare una scintilla elettrica se superano una certa soglia.
Praticamente lo strumento carica i condensatori in una prima fase, poi libera la corrente e conta il passaggio di ioni (ampere*h). Quando c'è stato un certo passaggio di ioni blocca la scarica e ti dà un valore in millisecondi del tempo passato dalle cellule a quel voltaggio.
Quindi il tempo di scarica non lo imposti tu, ma in genere è lo strumento a darlo a te.
Tu imposti i limiti minimi e massimi della scarica ed i parametri sono impostati secondo il ceppo cellulare, in genere 3->5 ms(min->max)
Ovviamente quando lo strimento ti dà tempi più alti indica che la soluzione non conteneva toppi ioni e schifezze e l'efficienza dell'elettroporazione sarà sicuramente migliore, in genere 4.5 ms per E. coli, durata lunga = maggiore efficienza.
Tempi molto bassi indicano una forte contaminazione di ioni o un eccesso di DNA, bassa efficienza, in genere 3 ms... se le cose vanno ancora peggio c'è la scossa e la celletta esplode insieme ai batteri. Negli strumenti moderni è possibile andare anche sotto i 3 ms, quindi il rischio esplosione è minimo anche se a volte aviene lo stesso in maniera molto più modesta.
Per i parametri francamente non ricordo, ma potrei recuperarli dallo strumento domani.
Non credo però che ti siano particolarmente utili, poiché dipendono dalle cellette che usi, dal ceppo batterico, dal protocollo con cui fai le cellule e dallo strumento. Si devono fare dei tentativi o chiedi alla casa produttrice dell'apparecchio se ti danno un protocollo standard da cui partire per fartene uno tuo.
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SOLUZIONE PER ELETTROPORAZIONE???
Didattica
