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chups
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Inserito il - 28 gennaio 2008 : 16:59:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chups Invia a chups un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
a tutti gli utenti del forum!
Studiando varie metodiche di clonaggio,mi sono imbattuta nell'uso della topoisomerasi,impiegata nel "clonaggio TA".Mi piacerebbe che qualcuno mi spiegasse il perchè(o eventuali vantaggi/differenze)dell'uso di questo enzima al posto della ligasi.
Grazie!!

Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2008 : 18:12:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il vantaggio notevole è che ha un'efficienza di clonaggio estremamente alta e poi ha anche una certa facilità di utilizzo.

Non si trattà nè di una ligasi, in realtà è una topoisomerasi che è legata covalentemente ad un vettore aperto.
Quando il DNA proveniente da una PCR, con delle estremità di Adenina, si appaia al vettore con delle estremità di Timina, la topoisomerasi lega le due estremità e si allontana dal vettore, in modo tale che la reazione sia praticamente irreversibile.

La ligasi è un enzima libero che ha l'inconveniente di polimerizzare sia il frammento che il vettore e legare anche tutto quello che c'è in soluzione e che non è stata incobata con la CIP. Poi se non lavori bene in genere ci sarà anche un po' di vettore non digerito o digerito troppo con siti rovinati che daranno i classici mostri quando ligati a caso.

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chups
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 10:28:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chups Invia a chups un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie,neuroscience..Ti ho appena eletto mio salvatore personale!Alla prossima
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Cangrande
Utente Junior

Cangrande Della Scala

Prov.: Verona


280 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 17:08:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Cangrande Invia a Cangrande un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi sembra la discussione giusta... voi per il T-A cloning che rapporto frammento vettore utilizzate? Mi spiego meglio. Ho visto che esistono varie formulette per calcolarlo e vorrei sapere qual'è la migliore secondo la vostra esperienza.

Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala.
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 17:30:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il rapporto frammento vettore in genere si utilizza per la ligasi, se leggi il protocollo del Topo cloning non fa alcun riferimento alla quantità di DNA del frammento, ma solo al volume in cui è disciolto.
Non so la quantità di frammento ideale, ma ad ogni modo tutti quelli che conosco non quantizzano mai, mettono direttamente 1 ul di Topocloning, buffer e il volume massimo della soluzione che contiene il frammentino da clonare. Anche io ho fatto sempre così e non ho avuto mai problemi.
Per i dettagli puoi consultare il catalogo. Appartiene alla invitrogen mi pare.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 22:25:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io ho usato sia 0,5ul che 1ul e in entrambi i casi è funzionato bene!
Comunque il manuale è questo:
pentr_dtopo_man.pdf

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 22:40:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anche se è più o meno uguale...

quello non credo sia il topo cloning ta, trattasi invece della versione direzionale del blunt

quello che usavo io era questo http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2008 : 23:23:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si hai ragione...
ho linkato quello sbagliato... (anche se il senso è più o meno lo stesso)
Ho cercato Topo Cloning ed è uscito questo!!!
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