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 Biologia Molecolare
 Espressione e purificazione di piccole proteine.
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ginetto
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7 Messaggi

Inserito il - 03 febbraio 2008 : 19:46:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ginetto Invia a ginetto un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve gente.
E' da 1 anno e mezzo che cerco di esprimere e purificare piccole proteine (50aa) a sequenza casuale e quindi non naturali.
Come vettori ho usato un plasmide derivato dal pUC (credo) e il pET14b, diversi ceppi cellulari come BL21(DE3)pLys, BL21-AI, DH5alpha, XL1Blue, JM109.
Col il primo vettore la proteina ha sequenza leader pelB per il trasporto verso lo spazio periplasmatico e histag per la purificazione. Inoltre, in particolari ceppi, pu├▓ essere espressa come proteina di fusione alla proteina III del fago filamentoso M13.
Con il secondo vettore la proteina ha solo l'histag.
Abbiamo fatto molte prove di espressione e purificazione senza alcun risultato! :-(
Le cellule sono state indotte con IPTG 1mM (BL21-AI richiede anche Arabinosio 0,2%), a diverse temperature (20, 30, 37┬░C) e per tempi diversi (3ore e over night). Ma non vi ├Ę nessuna banda evidente di espressione.
Si sono tentate purificazioni con biglie magnetiche al nickel che chelano le istidine e colonne al nickel.
Con il pET14b sono stati fatti diversi western blot ed espressione in vitro con e senza metionina radioattiva.
Tutto senza alcun risultato evidente.
Avete qualche consiglio o idea?

Se vi serve qualche dato che ho omesso, chiedete pure.

Se queste proteine non vogliono saltar fuori almeno vorrei illustrare le possibili problematiche per la loro scarsa o nulla espressione.

HELP ME!!

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