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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 17:05:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
una domanda: i primers che si usano nella PCR sono fosforilati in 5'? o normalmente gli oligo sintetici presentano 5'OH e 3'OH? mi sono posta la domanda perchè il metodo per il clonaggio in vettori blunt-ended non fosforilati di prodotti di PCR (come pMOS per capirci) prima della ligazione al vettore presentano una fase di fosforilazione dell'inserto...
grazie a chi può rispondermi!!

Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 18:25:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per puro caso ho appena letto per il TA Cloning dal libro "From Genes to Genomes" che gli oligo sintetici non sono fosforilati al 5'...



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Silvy
Nuovo Arrivato

Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario


26 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 19:37:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Silvy Invia a Silvy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Esatto, non sono fosforilati al 5'...Purtroppo ne so qualcosa, nel senso che lo scorso anno, mentre facevo un clonaggio blunt, inizialmente defosforilavo il vettore senza tener conto del fatto che gli oligo per amplificare l'inserto fossero defosforilati al 5'
Il problema di attuare un clonaggio di questo tipo è che durante la ligazione, molti vettori, non essendo defosforilati, si chiuderanno su sè stessi e quindi avrai molte colonie trasformate dal solo vettore senza inserto...
Cmq c'è sempre l'opzione di acquistare oligo fosforilati al 5' (ovviamente costeranno di più)oppure di fosforilare l'inserto ottenuto.
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