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cimemole
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 20:50:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cimemole Invia a cimemole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, mi piacerebbe avere unn consiglio per quanto riguarda contaminazioni di DNA in campioni di RNA.
Io generalmentre tratto i miei campioni con DNase I per eliminare l'eventuale genomico presente, però il problema è un altro: siccome ho estratto l'RNA da cellule trasfettate, ho contaminazione di DNA plasmidico; me ne accorgo perchè quando faccio real time sull' RT -, ho comunque amplificazione, e non può essere contaminazione di DNA genomico, perchè i primers sono scelti a cavallo tra gli esoni, quindi sono giunta alla conclusione che ho contaminazione di DNA plasmidico che non riesco ad eliminare con trattamento con DNase I.
Potreste darmi qualche consiglio??? Ci sto davvero perdendo del tempo...ed ho necessariamente bisogno di avere risultati!!!

Grazie mille,
Cinzia

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2008 : 08:22:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di che ditta è la DNAse I?
Con cosa estrai l'RNA?
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cimemole
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2008 : 12:39:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cimemole Invia a cimemole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La DNase I è della Roche, ed estraggo l'RNA con il Trizol (Invitrogen)



Citazione:
Messaggio inserito da cin

Di che ditta è la DNAse I?
Con cosa estrai l'RNA?

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Luca Beretta
Nuovo Arrivato


Città: Milano


12 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:04:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca Beretta Invia a Luca Beretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
con cosa stai facendo Real Time? TaqMan o SYBR Green? Perchè se hai segnale con il SYBR possono essere semplicemente dei dimeri di primer (basta diminuire la concentrazione dei primer).
E poi occhio, anche se costruisci un saggio a cavallo di giunzione esone/esone, se l'introne è piccolo il saggio può detectare anche il genomico!
Per il trattamento con DNase prova la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907

Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC)

Ciao
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Luca Beretta
Nuovo Arrivato


Città: Milano


12 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:06:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca Beretta Invia a Luca Beretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
DNase I non è solo di Roche, anzi!

Per il trattamento con DNase provate la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907

Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC). AM9738

Ciao
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:50:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Luca, ma per caso lavori per AB? (me lo chiedo visto che in tutti i tuoi messaggi continui ad elogiarli)
Ora, non è che abbiamo problemi di sorta a mettere sul forum pareri sui vari prodotti delle varie marche, però gentilmente cerchiamo di limitare la pubblicità gratuita...

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Luca Beretta
Nuovo Arrivato


Città: Milano


12 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:00:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca Beretta Invia a Luca Beretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No no, solo utilizzo i loro prodotti da una vita e mi trovo bene.
va bene non vi darò più i codici, al limite chi li vuole ne parliamo via mail.
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Topogigio77
Nuovo Arrivato


Città: Milano


37 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:11:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Topogigio77 Invia a Topogigio77 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
concordo
ciao
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:44:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
No no, solo utilizzo i loro prodotti da una vita e mi trovo bene.
va bene non vi darò più i codici, al limite chi li vuole ne parliamo via mail.


Don't worry, scrivi pure i codici non è un problema è solo che mi ero appena letto 5 o 6 dei tuoi messaggi ed avevo avuto questa impressione!

PS: benvenuto sul forum!

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cimemole
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2008 : 22:31:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cimemole Invia a cimemole un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Wow, grazie dei consigli...Cmq gli oligo sono scelti a cavallo, ma con introni molto grandi in mezzo.
Invece per la Real Time uso il Sybr Green e non credo si tratta di dimeri di primers perchè ho dei picchi di dissociazione alla stessa Tm del mio campione di interesse.

Cmq grazie per i consigli sui prodotti, ne parlerò con le altre persone del lab

Ciao



Citazione:
Messaggio inserito da Luca Beretta

Ciao,
con cosa stai facendo Real Time? TaqMan o SYBR Green? Perchè se hai segnale con il SYBR possono essere semplicemente dei dimeri di primer (basta diminuire la concentrazione dei primer).
E poi occhio, anche se costruisci un saggio a cavallo di giunzione esone/esone, se l'introne è piccolo il saggio può detectare anche il genomico!
Per il trattamento con DNase prova la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907

Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC)

Ciao

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