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Dionysos
Moderatore

D
Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2008 : 21:00:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cito dal sito dell'NCBI:

Citazione:
Because a gene can be expressed as mRNA many, many times, ESTs ultimately derived from this mRNA may be redundant. That is, there may be many identical, or similar, copies of the same EST. Such redundancy and overlap means that when someone searches dbEST for a particular EST, they may retrieve a long list of tags, many of which may represent the same gene. Searching through all of these identical ESTs can be very time consuming.


Non riesco a capire una cosa:
se le EST sono ricavate dallo stesso trascritto, i suoi
cambiamenti QUANTITATIVI come possono ripercuotersi su
una maggiore variabilità di EST riferite allo stesso messaggero?

Anche nei miei appunti c'è una frase-chiave in merito
che non riesco a spiegarmi: <<Il numero di EST per gene
è un indice del livello di espressione del gene>>.

Perchè?
Mi manca il collegamento mentale, e credo sia di tipo tecnico.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2008 : 01:34:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Va beh ci provo a rispondere!
Dipende dal modo in cui vengono prodotte le ESTs.
In parole povere:
- estrai l'RNA
- retrotrascrivi in cDNA
- sequenzi dei "pezzetti" di cDNA (one-shot sequencing), cioè delle corte sequenze (che non corrispondo all'intero mRNA).
Se hai tanti mRNA del gene A hai più probabilità che "frammenti" di questo vengano sequenziati quindi:
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

<<Il numero di EST per gene è un indice del livello di espressione del gene>>.


ed è per questo che hai ridondanza in banca dati...

Qua trovi una serie di definizioni di ESTs:
Definitions of Expressed sequence tags
e poi ovviamente Wikipedia

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dallolio_gm
Moderatore


Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna


2445 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2008 : 11:55:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di dallolio_gm  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di dallolio_gm Invia a dallolio_gm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì più o meno é così anche secondo me.
Tu ti crei una libreria di cDNA (é spiegato anche nell'ncbi handbook che hai postato) e in quella, gli mRNA più espressi sono più rappresentati.
Considera che uno dei limiti delle ESTs é proprio che gli mRNA meno abbondanti non si vedono proprio, e questo é un problema se fai delle predizioni in silico.

Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-)
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2008 : 11:56:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Caaaara GFpina ()
Come si discuteva, c'è un dubbio che rimane:
com'è possibile ottenere diversi prodotti di sequenziamento (->EST)
da cDNA che comunque, per quanto molteplici, son tutti identici?

Occorrerà sequenziare in modo diverso, si diceva, ma sembra
che da definizione le EST siano sempre ottenute sequenziando
le estremità 3' UTR e 5' partendo da sequenze affiancate
appartenenti al plasmide in cui ogni cDNA è clonato!

Qualcuno si offre di risolvere il mistero?

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2008 : 00:43:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E io che speravo che la notte portasse consiglio!!!
o che almeno.....
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Qualcuno si offre di risolvere il mistero?


che qualcun altro si offrisse...

Va beh cercherò di essere più convincente sta volta

1. estrai l'mRNA (o l'RNA totale e poi isoli l'mRNA) --> qua ci siamo!!

2. retrotrascrivi a cDNA --> e qua viene il bello....
come retrotrascrivi? Hai 2 opzioni:
- A. oligodT primer: ottieni dei cDNA che partono tutti dalla fine dell'mRNA (polyA) ma dal medesimo mRNA puoi ottenere vari frammenti di diversa lunghezza a secondo di dove si ferma la reazione di retrotrascrizione (sopratutto per mRNA lunghi è difficile che venga retrotrascritto tutto)
- B. random primer: ottieni dei cDNA di diversa lunghezza, casuali, che possono partire da diversi punti dell'mRNA
e già qua abbiamo delle variabili da un mRNA (ad es. del gene A) ottieni vari "frammenti" di cDNA (ok?)

3. cloni i tuoi cDNA all'interno di vettori e ti fai una libreria

4. sequenzi i tuoi cloni utilizzando primers "universali" (passatemi il termine) che si annelano ("inglesismo") con sequenze del vettore fiancheggianti il cDNA inserito.

5. fai delle reazioni di sequenziamento brevi e solo forward o solo reverse (o anche a basso costo) --> ottieni delle sequenze non bellissime e che possono contenere errori (ad es. mancanza di alcune basi)
(insomma per dirla in parole povere viene preferita la "quantità" rispetto alla "qualità")
inoltre se il "frammento" di cDNA inserito è lungo può anche darsi che non lo sequenzi tutto ma solo una parte.

Alla fine ottieni tanti "frammenti" di sequenze che non rispecchiano tutto l'mRNA ma parti di esso, se fai un allineamento tra l'mRNA e queste sequenze vedrai che di appaiano in vari punti dell'mRNA e in alcuni punti possono essere sovrapposti!

N.B. tenete conto che ho cercato di semplificare un po' il tutto per renderlo chiaro!!!

Altra cosa da considerare è che le ESTs sono state fatte da varie persone e ognuno ha utilizzato il suo metodo, non credo che esista "la regola generale", ho anche letto di alcuni che retrotrascivevano con oligodT e poi "smangiavano" (non mi viene un termine più appropriato!) le sequenze di cDNA al 3' o al 5' prima di clonarle.

Tutto questo ha generato una grande "ridondanza" di dati (o anche una gran confusione per come la vedo io!)

Per quanto riguarda il fatto che se un gene è più espresso ci sono più ESTs è chiaro vero???

Ho trovato anche questa review che "dovrebbe" spiegare la cosa più approfonditamente:
What is an EST?
però da casa (o meglio dall'Università Italiana non ho accesso), dovrei provare dal lavoro, ma non prima di lunedì , ma se qualcuno ha accesso si faccia avanti...
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