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Marianna
Utente Junior




146 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2008 : 19:04:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ci risiamo! Come prendo in mano un clonaggio cado nella disperazione!

Vi snocciolo qualke punto dolente...

1) la quantità di vettore che devo digerire (quindi siamo ai primissimi passaggi)..quanto mi consigliate?

2) E' possibile ke dopo la purificazione delle PCR con il kit della Qiagen (questione ke mi aveva già afflitto qualke giorno fa in una precedente discussione) il DNA puzza sempre di etanolo e quindi è "sporco"..alias si inibisce la ligasi?

Premetto ke stamattina sono passata in lab a guardare le piastre..i controlli + erano belli cresciuti..i controlli - erano tali...la ligasi ovviamente vuota!

Farah

mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 00:49:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao
sarebbe opportuno digerire quanto piu vettore possibile dato che cmq te ne perdi molto quando purifichi...ti consiglio di fare un centrifugata in piu x eliminare til piu possibile le tracce di etanolo
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morgan79
Utente Junior

insuperabile

Prov.: Bari


143 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 09:37:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di morgan79  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di morgan79 Invia a morgan79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se leggi con attenzione il protocollo del nucleotide removal kit della qiagen, ti consiglia dopo i lavaggi con washing buffer e prima della eluizione con acqua sterile o eluition buffer, una centrifugata a secco di un minuto a tredicimila rpm.... è un passaggio fondamentale dopo il quale, ti assicuro, non ci sarà nessunissima traccia di etanolo.

oppure puoi fare come me quando non ho tempo per usare il kit qiagen oppure quando ho pochissima pcr e non posso permettermi di diluirla con kit qiagen: ci faccio una centrifugazione con colonna impaccata con sephadex g50, la stessa che uso per purificare le reazioni di sequenza

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare
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Marianna
Utente Junior




146 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 11:56:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La centrifugata a secco la faccio e ti assicuro che dopo l'eluizione l'etanolo si sente ancora...forse dovrei farne + di una..nn credo possa accadere nulla x una centrifugata in più.. no?

Farah
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 25 febbraio 2008 : 15:25:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Puoi provare a farla con il tappo aperto (io faccio sempre così...)
Ciao
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