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Autore

Discussione

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2008 : 19:04:20

Ci risiamo! Come prendo in mano un clonaggio cado nella disperazione!

Vi snocciolo qualke punto dolente...

1) la quantità di vettore che devo digerire (quindi siamo ai primissimi passaggi)..quanto mi consigliate?

2) E' possibile ke dopo la purificazione delle PCR con il kit della Qiagen (questione ke mi aveva già afflitto qualke giorno fa in una precedente discussione) il DNA puzza sempre di etanolo e quindi è "sporco"..alias si inibisce la ligasi?

Premetto ke stamattina sono passata in lab a guardare le piastre..i controlli + erano belli cresciuti..i controlli - erano tali...la ligasi ovviamente vuota!

Farah

mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht

348 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 00:49:39

ciao
sarebbe opportuno digerire quanto piu vettore possibile dato che cmq te ne perdi molto quando purifichi...ti consiglio di fare un centrifugata in piu x eliminare til piu possibile le tracce di etanolo

morgan79
Utente Junior

Prov.: Bari

143 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 09:37:01

se leggi con attenzione il protocollo del nucleotide removal kit della qiagen, ti consiglia dopo i lavaggi con washing buffer e prima della eluizione con acqua sterile o eluition buffer, una centrifugata a secco di un minuto a tredicimila rpm.... è un passaggio fondamentale dopo il quale, ti assicuro, non ci sarà nessunissima traccia di etanolo.

oppure puoi fare come me quando non ho tempo per usare il kit qiagen

oppure quando ho pochissima pcr e non posso permettermi di diluirla con kit qiagen: ci faccio una centrifugazione con colonna impaccata con sephadex g50, la stessa che uso per purificare le reazioni di sequenza

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2008 : 11:56:42

La centrifugata a secco la faccio e ti assicuro che dopo l'eluizione l'etanolo si sente ancora...forse dovrei farne + di una..nn credo possa accadere nulla x una centrifugata in più.. no?

Farah

RM
Nuovo Arrivato

115 Messaggi

Inserito il - 25 febbraio 2008 : 15:25:23

Puoi provare a farla con il tappo aperto (io faccio sempre così...)
Ciao