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 Quantificazione relativa e assoluta in real time
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vice05
Nuovo Arrivato


Prov.: Roma
Città: Roma


14 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 20:58:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di vice05 Invia a vice05 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao, dovrei fare una relazione sulla pcr real time, in laboratorio sto facendo esclusivamente pcr classiche e retrotrascrizioni, ma con la real time in sè non mi sono mai cimentato. Ho cercato già sul forum e in vari siti ma mi rimane comunque il dubbio. naturalmente con la quantificazione assoluta riesco ad avere la concentrazione del prodotto utilizzando uno standard di cui conosco già la concentrazione e di cui se non ho capito male si fanno diluizioni successive (come?) e su costruisce una curva standard. mentre con la relativa si osserva quanto un gene è espresso per esempio in un tessuto rispetto ad un altro ( o no?) senza avere un valore numerico della mia espressione ma si confrontano solo i due Ct. in tutto questo si è parlato anche di geni housekeeping e controlli endogeni...cioè?
mi chiarite la cosa

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 22:58:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un gene housekeeping è un gene che viene normalmente espresso da una cellula e generalmente a livelli medio-alti.
Per usarlo come controllo endogeno (o standard interno) in una realtime la sua espressione deve essere costante.

Quindi se tu hai controlli e trattati il tuo housekeeping dovrà essere in media lo stesso nei due gruppi, mentre il tuo gene di interesse potrà (o meno) essere influenzato dal trattamento.
Quando analizzi i Ct li riporti al tuo gene housekeeping (calcolando il delta Ct = Ct(housek) - Ct(gene X) ) e in questo modo elimini la variabilità dovuta al fatto di avere più o meno RNA totale nel campione.

Esempi di housekeeping sono l'RNA ribosomiale 18S o l'actina o la beta tubulina.
Vedi anche:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1423

La curva standard la fai partendo da RNA a concentrazione nota e diluendolo mano a mano di un numero di volte noto.

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vice05
Nuovo Arrivato


Prov.: Roma
Città: Roma


14 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 23:11:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di vice05 Invia a vice05 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se ho capito bene, quindi il confronto con l'housekeeping lo si fa solo nella quantificazione relativa ed in particolare si ricava quanto il gene x è più o meno espresso nel trattato rispetto al controllo eliminando la variabilità grazie alla "normalizzazione" delle Ct col gene housekeeping mentre nella quantificazione assoluta si costruisce solo la curva standard tramite la diluizione di un controllo a concentrazione nota e poi a secondo di dove c'ho la mia amplificazione allora il campiono avrà una concentrazione di X ng. dico bene?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 23:52:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, esatto.

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vice05
Nuovo Arrivato


Prov.: Roma
Città: Roma


14 Messaggi

Inserito il - 02 marzo 2008 : 01:16:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di vice05 Invia a vice05 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie ancora chick, un saluto a tutti Vincenzo
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alexius100
Nuovo Arrivato


Prov.: Firenze
Città: Firenze


6 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2008 : 11:04:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alexius100 Invia a alexius100 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusatemi ho da porvi una domanda.
Nel caso io voglia effettuare una quantificazione assoluta io devo usare uno standard ed eseguire diluizioni successive e crearmi così la mia curva standard. La domanda è: il mio standard può essere un gene diverso da quello di cui io voglio calcolarmi la concentrazione iniziale?
Spero di essere stato chiaro e vi ringrazio.
Ale

Ale
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mrgorefest
Nuovo Arrivato

alex_ferrari

Prov.: BA
Città: Bari


9 Messaggi

Inserito il - 28 dicembre 2009 : 08:04:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mrgorefest Invia a mrgorefest un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
supponendo che io voglia fare una quantificazione assoluta di un virus ad RNA(ad es. un flaviviridae) con Real-Time RT-PCR.
come costruisco lo standard?
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Saw
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2011 : 17:40:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Saw Invia a Saw un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok èer lo standard interno ma il calibratore cos'è?
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