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ribes
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 Inserito il - 17 marzo 2008 : 21:31:25
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Ciao ragazzi, ho avuto un problema con le cellule competenti M15..in pratica dopo l'elettroporazione e la crescita in SOC ho piastrato in LB agar le mie cellule nelle aliquote 10,50 e 100 microlitri e dopo 24h erano cresciute in maniera ottimale nell'aliquota 50. a questo punto ho piastrato tutta la soluzione di elettroporazione (50 microlitri per piastra con X-gal)solo che dopo 24h non mi è cresciuta nessuna colonia!!!!! non capisco dove sia stato l'errore...
se qualcuno sa qualcosa mi potrebbe indicare i possibili errori commessi?
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 12:17:03
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Fammi capire, tu hai elettroporato il giorno X e hai piastrato parte della miscela di elettroporazione, il giorno X+1 hai ottenuto colonie e hai piastrato quello che avevi avanzato?
Se è così il problema potrebbe essere che le tue M15 elettroporate non siano state conservate in modo ottimale e che siano morte tutte, quindi quando hai piastrato l'avanzo in realtà erano morte.
Se invece ho capito male mi scuso.
ciao |
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ribes
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2008 : 10:18:42
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penso anche io che siano le competenti, perche ho elettroporato per altre 4 volte e non è cresciuto nulla.....ma tu come le prepari le competenti? a questo punto mi viene il dubbio che non siano state bloccate (in fase di crescita) nella fase esponenziale....
grazie
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2008 : 18:39:54
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| Un domanda. Perchè utilizzi questa procedura? |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2008 : 11:59:50
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le cellule competenti le compro perchè ho visto che ho una resa notevolmente superiore e alla fine mi vengono a costare meno. Inoltre dopo varie prove ho notato che per me è molto meglio la trasformazione per heat shock piuttosto che l'elettroporazione. In ogni caso le cellule elettrocompetenti le preparo così:
Preparazione di cellule elettrocompetenti
Il ceppo di E. coli utilizzato è: Xl1-Blue; supE44hsdR17recA1endA1gyrA46thirelA1lac-
F’[proAB+lacqZ_M15Tn(Tetr)]
- Inoculare una singola colonia in 5 ml di terreno LB e lasciare a 37° C in agitazione tutta la notte;
- trasferire 1 ml della coltura in 100 ml di terreno LB e lasciare crescere a 37° C in agitazione fino ad una densità ottica pari a 0.6;
- trasferire la coltura in provette Falcon da 50 ml e tenere in ghiaccio per 10 minuti;
- centrifugare a 4000 rpm per 15 minuti a 4° C e lavare due volte con 50 ml di glicerolo al 10 %;
- centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4° C;
- risospendere delicatamente le cellule in terreno GYT freddo in modo tale da avere un volume finale di 1 ml;
- suddividere in aliquote da 40 _l in criofiale pre-raffreddate e congelare a -80° C.
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2008 : 12:02:58
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le cellule competenti le compro perchè ho visto che ho una resa notevolmente superiore e alla fine mi vengono a costare meno. Inoltre dopo varie prove ho notato che per me è molto meglio la trasformazione per heat shock piuttosto che l'elettroporazione. In ogni caso le cellule elettrocompetenti le preparo così:
Preparazione di cellule elettrocompetenti
Il ceppo di E. coli utilizzato è: Xl1-Blue; supE44hsdR17recA1endA1gyrA46thirelA1lac-
F’[proAB+lacqZ_M15Tn(Tetr)]
- Inoculare una singola colonia in 5 ml di terreno LB e lasciare a 37° C in agitazione tutta la notte;
- trasferire 1 ml della coltura in 100 ml di terreno LB e lasciare crescere a 37° C in agitazione fino ad una densità ottica pari a 0.6;
- trasferire la coltura in provette Falcon da 50 ml e tenere in ghiaccio per 10 minuti;
- centrifugare a 4000 rpm per 15 minuti a 4° C e lavare due volte con 50 ml di glicerolo al 10 %;
- centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4° C;
- risospendere delicatamente le cellule in terreno GYT freddo in modo tale da avere un volume finale di 1 ml;
- suddividere in aliquote da 40 _l in criofiale pre-raffreddate e congelare a -80° C.
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ribes
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3 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2008 : 19:56:52
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ciao Eleo,
grazie per il protocollo di preparazione provero anche con le tue indicazioni alla preparazione delle cellule.
A me veramente le fanno preparare le competenti anzichè comprarle!
la cosa che mi lascia perplessa è che le cellule sono state bloccate all'OD che hai indicato tu (ho ricontrollato le letture)e suddivise in aliquote da 110 microlitri perche utilizzo un volume di reazione ligation da 20 microlitri.
per prova cmq ho rivitalizzato un'aliquota competente M15 in LB e cmq è cresciuto parecchio.
ho fatto diverse prove questa settimana per escludere le diverse variabili dell'esperimento, a un certo punto mi è venuto il dubbio che fosse l'X-gal dato che l'ho comprato in polvere e l'ho sciolto in formammide che è tossica per le cellule e cmq l'X-gal non è..
quindi a questo punto potrebbe un problema di ligation...un problema con l'elettroporatore lo escluderei perchè ci sono altri colleghi che lo usano e non hanno avuto problemi di questo tipo.
Conosci un modo per verificare che la ligation sia avvenuta correttamente prima di iniziare la trafila dell'elettroporazione-piastramento-librerie ecc ecc???
grazie per i tuoi preziosi consigli.
dimenticavo...dove le compri le competenti??? |
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Eleo
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Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2008 : 13:37:58
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dopo la ligazione non c'è modo di controllare cos'hai in mano se non trasformando, piastrando e vedendo cosa cresce e cosa contiene. Prova a trasformare per heat shock chiedendo a qualcuno di prestarti un'aliquota di cellule per tale procedura. Le cellule le compravo dall'invitrogen e dalla promega se non ricordo male, costano molto, ma funzionano benissimo.
Ti dico di provare con l'heat shock perchè quando usavo l'elettroporatore a volta le cellule mi "zottavano" perchè usavo un eccesso di DNA (bastava davvero poco più di 1 ng...a volte dovevo usarne 0,5 ng e avendo uno spettrofotometro un po' problematico spesso erano problemi).
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vega
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Prov.: catania
Città: catania
8 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2008 : 12:55:52
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| nn so se può tornarti utile, ma io risospendo l'X-gal in DMSO |
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problema con cellule competenti
Didattica e Relazioni
