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elisa23
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 26 marzo 2008 : 09:13:14
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CIAO! Il mio problema è il seguente... devo fare un estratto citosolico per fare il dosaggio dell'attività della caspasi-3 su cellule endoteliali... ho usato il seguente buffer di lisi per estrarre le proteine:
TRIS-HCl 1 M
NaCl 5 M
EDTA 0.5 M
TRITON X-100 1%
APROTININA 1ul/ml
PMSF 5 ul/ml
Facendo agire questo buffer per circa 30 minuti in ghiaccio, non riesco però ad ottenere una quantità di proteine sufficiente per fare il mio saggio.... Il mio dubbio è che effettivamente questo buffer non sia adatto... (ho già guardato parecchio in letteratura e ho chiesto un pò in giro, l'unica cosa che mi è stata detta è di piastrare più cellule, cosa che peraltro o già fatto e comunque non ho risolto il problema...). Gli inibitori delle proteasi vanno aggiunti appena prima dell'utilizzo? Utilizzare il TRITON al posto dell' NP-40 è più o meno la stessa cosa? Così mi hanno detto... Comunque se qualcuno ha qualche suggerimento in merito è ben accetto!! Vi ringrazio anticipatamente!
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2008 : 10:50:02
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| prova ad usare un volume minore di buffer e usare più cellule in modo da avere una concentrazione più alta. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2008 : 14:10:36
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allora, per mia esperienza posso suggerirti di usare un volume di buffer adeguato, come dico sempre, è buona norma usare un volume di lysis buffer 3 volte superiore al volume del pellet cellulare.
poi, altra cosa importante, non è sufficiente far avvenire la lisi in ghiaccio, ma c'è bisogno anche di movimento! se non hai uno shaker orbitale in camera fredda, allora tieni i tuoi campioni in ghiaccio e vortexa ogni 5 minuti, senza farli riscaldare.
Citazione:
Messaggio inserito da elisa23
Gli inibitori delle proteasi vanno aggiunti appena prima dell'utilizzo?
si. e magari prova ad aggiungere anche leupeptina e ortovanadato.
Citazione:
Messaggio inserito da elisa23Utilizzare il TRITON al posto dell' NP-40 è più o meno la stessa cosa?
su questo non vorrei sbagliare, ma credo che l'NP40 abbia un potere detergente maggiore del triton.
Puoi provare ad usare anche questo buffer:
Tris HCl 50mM pH 7.4
NaCl 150mM
EDTA 1mM pH 8
Na-deossicolato 0.25%
NP-40 1%
con gli inibitori da aggiungere al momento dell'uso.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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elisa23
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2008 : 15:23:36
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Grazie per le vostre risposte... proverò a fare come mi avete suggerito.... Sapevo che in molte ricette di buffer di lisi si usasse l'NP-40 e Na-deossicolato, il problema è che qui in laboratorio non ne abbiamo, per cui sto cercando di arrangiarmi come posso... Tra l'altro ho anche un altro dubbio relativo al dosaggio proteico con Bradford, visto che è possibile che l'uso di certe concentrazioni di detergenti interferiscano con il dosaggio stesso.... Comunque riproverò ed eventualmente vi farò sapere!
Grazie ancora!! |
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