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 Western Blot: mettere a punto un protocollo
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ivanarubik
Nuovo Arrivato

Città: losanna


14 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 14:27:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ivanarubik Invia a ivanarubik un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno,
sto cercando di fare un western blot per una proteina transmembrana ma sono molto lontana dall'avere un risultato....vorrei sapere in che modo i diversi steps del protocollo ed i reagenti influenzano la performance...
Grazie per l'aiuto!!

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 16:14:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
secondo me (e ne faccio molti) i parametri che influenzano la resa dell'esperimento in maniera pesante e che possono essere variati sono:
- preparazione del campione (devi cercare di averlo più pulito possibile, cioè senza membrane e schifezze varie che possono sporcare il filtro e quindi la lastra);
- percentuale del gel (percentuali sbagliate ti portano alla perdita della proteina (se poco concentrato) o alla non separazione da eventuali aspecifici (se troppo concentrati)
- diluizione anticorpo primario (se non vedi la proteina prova a diluire di meno)
- diluizione secondario (se vedi sporcizia prova a diluirlo di più)
per ultimo può capitare (e a me è capitato) che se hai un policlonale, alcuni tipi di latte (soprattutto se molto grassi) possono interferire, dandoti un segnale basso o farlo sparire.
prova a variare a turno questi parametri e vedrai che trovi le tue condizioni!
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 16:30:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:

per ultimo può capitare (e a me è capitato) che se hai un policlonale, alcuni tipi di latte (soprattutto se molto grassi) possono interferire, dandoti un segnale basso o farlo sparire.


Noi usiamo un latte senza grasso...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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ivanarubik
Nuovo Arrivato

Città: losanna


14 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 16:48:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ivanarubik Invia a ivanarubik un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
grazie per i suggerimenti....dunque, hai ragione per quanto riguarda il lisato di partenza ma trattandosi di una proteina di membrana sono costretta ad utilizzare l'intera cellula.
Da qualche parte ho sentito che potrei modificare la percentuale di Tween 20, per il momento è o,05%. Sapete per caso in che modo aumentare/diminuire il Tween modifica il risultato??
avete mai provato a sonicare il lisato prima di depositarlo? se si, per quanto tempo?
Grazie
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Eleo
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


89 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2008 : 16:46:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eleo Invia a Eleo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per i miei w.b. (mai per proteine di membrana però) lisavo le cellule in Laemmli buffer, bollivo per 5 minuti poi sonicavo 4 cicli da 10 secondi l'uno e tra un ciclo e l'altro ponevo i campioni per 10 sec in ghiaccio, se dopo aver sonicato notavo che il campione era ancora troppo viscoso, in genere o sonicavo ancora per un paio di cicli, oppure passavo i campioni in una siringa da insulina con l'ago tagliato (per ridurre il diametro dell'ago), si ottengono buoni risultati anche siringando il campione senza sonicarlo, ma se hai poco campione siringando rischi di perderne un po' troppo dato che un po' rimane sempre nella siringa.
Prima di caricare il gel poi bollivo sempre i campioni per altri 5 minuti.
ciao
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2008 : 19:16:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ivanarubik

Ciao,
grazie per i suggerimenti....dunque, hai ragione per quanto riguarda il lisato di partenza ma trattandosi di una proteina di membrana sono costretta ad utilizzare l'intera cellula.
Da qualche parte ho sentito che potrei modificare la percentuale di Tween 20, per il momento è o,05%. Sapete per caso in che modo aumentare/diminuire il Tween modifica il risultato??
avete mai provato a sonicare il lisato prima di depositarlo? se si, per quanto tempo?
Grazie



per le proteine di membrana (io ho lavorato sull'EGFR) devi usare un buffer di lisi specifico, altrimenti rischi che la proteina resti all'interno della membrana e ne estrai quantità minime.
altra cosa che puoi fare (io mi sono trovata benissimo) è quella di passare il campione, prima di mettere la lisi in camera fredda, in ago da insulina, cioè aspiri e ributti tutto in eppendorf per 3 o 4 volte (si formerà della schiuma). per il tween, io lavoro con la stessa tua percentuale, ma ti ripeto, per proteine integrali di membrana uso un buffer specifico (e se non erro uso il triton al posto del tween). ora non sono in lab, ma se ti occorre posso darti la ricetta del mio buffer.


...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: milano


18 Messaggi

Inserito il - 28 aprile 2008 : 15:39:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di annamaria_mi Invia a annamaria_mi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sfrutto questa discussione..iside risci a darmi la ricetta del buffer di lisi e il protocollo per l'estrazione delle proteine di membrana (centrifugate e per quanto)? ma in qst modo ottieni le proteine di membrana totali immagino, non solo plasmalemma ma anche organuli vari..sapete se oltra a kit con ricetta "segreta" ci sn dei kit a composizione nota per separare le sole membrane plasmatiche??
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orcaimpetuosa
Utente Junior



234 Messaggi

Inserito il - 28 aprile 2008 : 15:53:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di orcaimpetuosa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di orcaimpetuosa Invia a orcaimpetuosa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ivanarubik

Ciao,
grazie per i suggerimenti....dunque, hai ragione per quanto riguarda il lisato di partenza ma trattandosi di una proteina di membrana sono costretta ad utilizzare l'intera cellula.
Da qualche parte ho sentito che potrei modificare la percentuale di Tween 20, per il momento è o,05%. Sapete per caso in che modo aumentare/diminuire il Tween modifica il risultato??
avete mai provato a sonicare il lisato prima di depositarlo? se si, per quanto tempo?
Grazie


per prot. di membrana il tween lo uso anch'io a qualla percentuale e funziona,
ho provato a sonicare un poco (nel mio caso si tratta di tilacoidi)...
ora ho su l'anticorpo secondario, poi ti faccio sapere cosa è venuto
piuttosto che modo usi per la rilevazione?
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 28 aprile 2008 : 17:22:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da annamaria_mi

sfrutto questa discussione..iside risci a darmi la ricetta del buffer di lisi e il protocollo per l'estrazione delle proteine di membrana (centrifugate e per quanto)?


si allora, il buffer di lisi è:
Tris HCl 50 mM pH 7.4
NaCl 50 mM
TRITON-X 1%
EDTA 1 mM
EGTA 1 mM
MgCl2 5mM

per quanto riguarda l'estrazione, io in genere faccio immunoprecipitazioni, quindi il protocollo è un po' diverso da quello di un semplice w.b. In ogni caso, il buffer di lisi lo lascio agire per 30 minuti (a volte anche 45) in agitazione costante. Poi, prima di centrifugare per raccogliere l'estratto, passo il tutto in ago da insulina per 4 o 5 volte. Poi ancora, centrifugo per 30' a 14000rpm in centrifuga refrigerata.
altro?


...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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francy83
Nuovo Arrivato



1 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2008 : 11:51:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di francy83 Invia a francy83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sto cercando di fare un western per delle citochine come tgfbeta e Il6.le bande del marcatore di peso molecolare che vedo durante la corsa sono sfumate e storte..ho utilizzato prima un voltaggio di 200volt per 1.5 ore..ma anche abbassando a 80 volt la situazione non cambia..inoltre sviluppando la pellicola dopo un'esposizione di 5 min la pellicola appare piuttosto scura e sporca..ma diminuendo a 2.5 minuti le bande non si vedono.qualcuno ha dei suggerimenti per me?
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: milano


18 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2008 : 13:22:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di annamaria_mi Invia a annamaria_mi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok iside grazie mille, quindi per estrarre proteine di membrana usi solo questo buffer..perchè io nel vecchio laboratorio usavo un kit che chiedeva upper e lower phase, ma con ricette sconosciute..spero di riuscire..sai se la composizione del buffer potrebbe essere più o meno efficace a seconda del tipo cellulare??grazie
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