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mandolino
Nuovo Arrivato

Città: Trondheim

17 Messaggi

Inserito il - 21 aprile 2008 : 20:49:42

Ciao a tutti. ho trasformato e.coli BL21(DE3) con un vettore di clonazione (sotto il controllo del promotore T7) codificante per una proteina di fusione (proteina fusa con His tag). Ho indotto l'espressione con IPTG 1mM quando la coltura ha raggiunto una OD600 di circa 0,5 e ho seguito il protocollo fornito dal kit della quiagen che fa uso delle Nichel-NTA colums in condizioni denaturanti dato che la mia proteina dovrebbe essere una proteina di membrana che codifica per una ferrodossina reduttasi..bene, non ho trovato un bel niente! Nella sequenza del gene che ho clonato nel vettore non ci sono frameshift e nemmneno nella sequenza del promotore..qualcuno ha idea di quale possa essere la causa? Penso sia veramente improbabile che la proteina non venga espressa dato che le BL21(DE3) possiedono la polimerasi di T7 e il vettore ha questo promotore forte! Io sospetto che la proteina venga degradata ad opera di qualche proteasi di E. coli..ma come inibirla? La seconda possibilità, ma più remota, è che ci sia qualche mutazione nella sequenza del vettore..
Grazie in anticipo per il vostro aiuto

RNA world
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 21 aprile 2008 : 23:24:41

Ciao mandolino,

alcune considerazioni:

1) usi un protocollo particolare per l'espressione della tua proteina visto che si tratta di una proteina di membrana?

2) aggiungi inibitori di proteasi dopo la lisi delle cellule (ci sono delle tavolette della roche ad esempio molto comode che si aggiungono al lisato, ma ogni lab ha il suo inibitore di solito).

3) Con che conc. di imidazolo eluisci ?

ciao

mandolino
Nuovo Arrivato

Città: Trondheim

17 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2008 : 07:59:53

Ciao RNA world, in realta' il protocollo che ho seguito fa uso di buffer che contengono SDS e urea 8M..penso sia sufficiente ad ottenere tutte le proteine cellulari in forma denaturata! Non aggiungo inibitori delle proteasi, anche perche' si suppone che le BL21 dovrebbero mancare di alcune di esse..ma inizio a pensare che sia il caso di farlo. L'eluizione non viene fatta con imidazolo (ci ho gia' provato quando ho tentato di fare l'estrazione della proteina in condizioni native) ma si basa sull'uso di buffer che contengono urea 8M ma un pH decrescente cosicche' la coda di istidine si protona e non e' piu' in grado di legarsi alla resina (Ni-NTA) e la proteina dovrebbe essere eluita.
HELP!!

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