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ameliap
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2008 : 21:03:11
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ciao a tutti, questo forum è molto bello, ho sempre trovato consigli utili e, spesso mi sono chiarita un pò le idee!!
ho un problema e spero che mi diate una mano....
sto sequenziando dei pezzetti di un gene e ottengo degli elettroferogrammi un pò strani, almeno per me che non ho esperienza!
all'inizio i picchi sono ben definiti e alti ma poi verso le 300bp i picchi si abbassano diventando non solo bassi ma anche slargati e quindi illeggibili. Cambio sempre il buffer del sequenziatore automatico che uso e anche il polimero è sempre fresco!Non so da cosa possa dipendere, se dalla quantità di prodotto che uso per la reazione di sequenza o dalla quantità di reagenti. Io uso circa 50 ng di DNA genomico, faccio una pcr che purifico con exosap, per la reaz di seq uso il BDTerminator v.3.1 e per la purificazione successiva le biglie magnetiche. boh....non so che fare ....
scusate se sono stata un pò prolissa...
ciao e...grazie
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2008 : 00:04:04
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anche io sto utilizzando il sequenziatore, e faccio la tua stessa procedura. quello che ti posso dire per esperienza personale (benché minima) è che dipende molto dal "tipo" di polimero e di macchina. ci sono polimeri che permettono la lettura di oltre 300-400 basi. io infatti uso questo, e per sequenziare esoni di 400 e passa sono costretto a fare anche il reverse. sei sicura che la macchina lo permette? hai mai sequenziato (o altri nel lab) pezzi così grandi?
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2008 : 00:05:26
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| scusa, volevo dire che ci sono polimeri che NON prmettono... |
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Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2008 : 19:57:09
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si tratta di un problema o del poliemro o dei capillari.
innanzitutto chiama Applied 039.83.89.330 perchè a me è successo che un lotto di POP fosse fallato e me l'hanno sostituito. Dopo di che lava il tutto per bene con acqua (blocco, siringhe etc) e se possibile metti array nuovo, se il POP era andato ti ha distrutto anche i capillari. al 90% comunque è il POP, se hai un nuovo lotto provalo ma con capillari nuovi e dopo avere lavato. ricorda poi che non può stare a Temp ambiente per più di 1 settimana. ciao |
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ameliap
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2008 : 20:18:11
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ciao,
grazie per i consigli.
anche io cominciavo a pensare a polimero e capillare perchè ho variato (diminuendo visto che le pcr erano molto luminose su gel) le quantità di amplificato nella reazione di seq ma è venuto tutto uguale...
Il pop che ho usato era nuovo perchè avevo appena aperto la confezione...però scade a maggio quindi non so se me lo sostituiranno. io temo sia l'array infatti facendo analisi di frammenti la mia collega ha notato che uno dei capillari non funziona mai e abbiamo fatto meno di 100 corse. ho chiamato la ditta ma non mi hanno risposto, domani riprovo di certo!!! anche se dubito di brutto che mi sostituiscano il capillare..
ps approfitto ancora....posso conservare la pcr purificata in exosap e poi riutilizzarla per una nuova reazione?
grazie mille
ciao |
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Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2008 : 09:20:24
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yes, puoi riutilizzarla
e che cacchio, secondo me te lo devono cambiare...è garantito per 100 corse!
comunque secondo me è il POP
ciao |
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ameliap
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2008 : 21:48:23
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ciAOOO,
finalmete sono riuscita a parlare con l'help desk applera!! avevano ancora la segreteria telefonica dal ponte del primo maggio e allora ho chiamato il primo numero amministrativo che avevo e la situazione si è sbloccata. il POP 4 me lo cambiano subito, per il capillare vedremo ma spero proprio di si devo mandare un pò di corse che loro valuteranno.
grazie per l'exosap, immaginavo. Io conservo e riutilizzo, se mi serve, anche la sequenza purificata conservata con le biglie, e prelevo l'aliquota da caricare dopo aver lasciato per qualche minuto nella piastra magnetica....piuttosto, quando campione caricate per il sequenziatore? io 20 ma mi sembra molto e vorrei diminuire così come vorrei diminuire le biglie per cui la ditta consiglia 10 microlitri e anche di exosap te ne fanno usare tanto...viene a costare un sacco così 
ciao a tutti
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