| Autore |
Discussione |
|
|
robi_robi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
11 Messaggi |
 Inserito il - 24 maggio 2008 : 16:19:39
|
Ciao a tutti!
avrei questo problemino...
ho un frammento di questo tipo, tagliato con KpnI e HindIII:
cacgc.............gaca
catggtgcg.............ctgttcga
E' possibile inserirlo in un vettore che, se trattato con gli stessi enzimi, crea delle estremità così:
......gtac agcttga.......
......catggtac act.......
Si può fare? Come?
Grazie mille!!
|
|
|
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
 Inserito il - 24 maggio 2008 : 16:26:13
|
| le estremità sono complementari (hai utilizzato gli stessi enzimi!!!). quindi certo che puoi unirle. basta fare una ligasi! |
 |
|
|
robi_robi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
11 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2008 : 16:31:40
|
Ops...inviando la domanda si sono spostati i nucleotidi...
Quello che mi chiedevo era se pur utilizzando gli stessi enzimi ma che non creano le estremità complementari in termini di sporgenza si possono unire i frammenti..
ci riprovo (-=nucleotide):
Frammento:
........--------------------------
..--------------------------------------
Vettore:
----------..............------
----..............------------ |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2008 : 17:19:57
|
Ciao robi_robi!
Innanzitutto se vuoi che il testo ti rimanga allineato sul forum usa il tag code ([ code]…[/ code]), quello che ci scrivi all’interno rimane allineato.
Riguardo alla tua domanda, NO se le estremità non sono complementetari non puoi ligare il frammento nel vettore.
Però tu prima hai detto che frammento e vettore sono stati tagliati con gli stessi enzimi di restrizione:
KpnI
5'-G G T A C^C-3'
3'-C^C A T G G-5'
HindIII
5'-A^A G C T T-3'
3'-T T C G A^A-5'
Quindi dovresti ottenere delle sequenze complementari!
Non è che hai sbagliato a scrivere le digestioni?
Dovresti ottenere una cosa così:
(in grassetto sono le sequenze riconosciute dall’enzima di restrizione)
Frammento:
cacgc.............gaca
catggtgcg.............ctgttcga
Vettore:
.......ggtac agcttga.......
catggtac act.......
la parte sottolineata non sono sicura ci sia nella tua sequenza del vettore (sembra un pezzo di seq. riconosciuta da KpnI)
e unendoli otterresti questo:
.......ggtaccacgc.............gacaagcttga.......
catggtaccatggtgcg.............ctgttcgaact.......
|
|
|
|
robi_robi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
11 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2008 : 13:50:12
|
Ciao GFPina!
gli enzimi sono gli stessi si, quindi le estremità sono complementari...però è l'orientamento dei siti di restrizione che è diverso tra vettore e inserto!
Cioè, il frammento è come l'hai disegnato anche tu, ma il vettore no! è come l'ho fatto nella schematizzazione sopra, e cioè così:
-----------..........----------
-----..........----------------
e non così come servirebbe a me per il frammento che ho:
----------.......-------------
---.....................-------
..mi spiego? |
|
|
|
Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2008 : 15:42:08
|
ma hai capito che le basi devono essere complementari se no non si appaiano?..che frammento e' quello del primo post! ..che fai metti le "letterine" a caso??
poi le righe e i punti...metti i nt cosi' sei piu' chiara |
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2008 : 15:52:37
|
Ho capito benissimo cosa intendi robi_robi, il fatto è che è impossibile!!!
Cerco di spiegarmi.
Immanzitutto se tu avessi la situazione che hai descritto:
Frammento:
........--------------------------
..--------------------------------------
Vettore:
----------..............------
----..............------------
Non sono complementari e quindi non riesci a ligarli.
Comunque se hai utilizzato gli stessi enzimi questa situazione è impossibile!
Per HindIII ci siamo, i siti di resrtizione sono giusti, il problema è per KpnI!
La sequenza riconosciuta da KpnI è questa:
KpnI
5'-G G T A C^C-3'
3'-C^C A T G G-5'
Quindi nel tuo vettore dovresti avere:
N N N N N G G T A C^C N N N N
N N N N N C^C A T G G N N N N
Dopo taglio ottieni questo:
N N N N N G G T A C C N N N N
N N N N N C C A T G G N N N N
Questo rimane Questo se ne va
nel vettore
Essendo la sequenza riconosciuta da KpnI palindroma, letta al contrario è uguale!
L'unica possibilità che sia al "contrario" come dici tu è questa:
KpnI: Sequenza al contrario:
5'-G G T A C^C-3' 5'- C C A T G G -3'
3'-C^C A T G G-5' 3'- G G T A C C -5'
Nota che però adesso non è la stessa, perchè è diverso quello che hai al 5' e al 3'! --> questa sequenza non è riconosciuta da KpnI!!! Se utilizzi KpnI non la taglia!
Se vai a cercare tra gli enzimi di restrizione trovi che invece è la sequenza riconosciuta da NcoI:
5'-C^C A T G G-3'
3'-G G T A C^C-5'
Se invece intendevi che il frammento è tagliato prima da KpnI e poi da HindIII, mentre il vettore prima da HindIII e poi da KpnI avresti questa situazione:
Frammento:
. KpnI HindIII
5'-G G T A C^C N N N N N N N N N A^A G C T T-3'
3'-C^C A T G G N N N N N N N N N T T C G A^A-5'
ottieni questo:
. KpnI HindIII
C N N N N N N N N N A
C A T G G N N N N N N N N N T T C G A
Vettore:
. HindIII KpnI
5'- N N N N N N N N A^A G C T T N N N N N N N G G T A C^C N N N N N N N N -3'
3'- N N N N N N N N T T C G A^A N N N N N N N C^C A T G G N N N N N N N N -5'
ottieni questo:
. HindIII KpnI
5'- N N N N N N N N A C N N N N N N N N -3'
3'- N N N N N N N N T T C G A C A T G G N N N N N N N N -5'
Il frammento si attacca ma al contrario!
Altre situazioni mi sembra non ci siano!
|
|
|
|
robi_robi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
11 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2008 : 17:17:32
|
GFPina ok ho capito quello che dici!!
finalmente ho chiarito questo dubbio (il dubbio era sul sito di taglio al contrario :P)!
Grazie mille sei stata gentilissima e chiarissima!!
Ciao alla prossima
|
|
|
|
n/a
deleted
Città: Napoli
10 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 20:46:52
|
| Si, se produci un frammento privo di estremità appiccicose esso può essere inserito in qualsiasi vettore privo di estremità appiccicose anche se prodotto con enzimi diversi. Basterà aggiungere la ligasi che risalda l'impalcatura zucchero fosfato . Quando le estremità non sono complementari la ligazione dell'inserto nel vettore è addirittura più efficiente . |
|
|
|
Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2008 : 23:17:57
|
Citazione:
Messaggio inserito da dolceluna85
Si, se produci un frammento privo di estremità appiccicose esso può essere inserito in qualsiasi vettore privo di estremità appiccicose anche se prodotto con enzimi diversi. Basterà aggiungere la ligasi che risalda l'impalcatura zucchero fosfato . Quando le estremità non sono complementari la ligazione dell'inserto nel vettore è addirittura più efficiente .
Ma lavori nel laboratorio del Regno di Ozz ?
primo per avere frammenti privi di estremita' appiccicose devi usare polimerasi che non aggingono la A al tuo inserto
poi devi vedere se nella MCS ci sono enzimi che ti facciano un taglio blunt end e comunque sia corri sempre un rischio molto elevato ( a differenza di altri vettori) che si richiude su se stesso
poi puoi usare un frammento blunt end ed un vettore con estremita' protrudent poiche' i nt complementari possono essere polimerizzati,ma non e' al massimo efficente ( secondo me..non liga neanche ..e poi chi te lo fa fare? )
poi bellissimo..anche se le basi non sono complementari e' ancora piu' efficente ahhaahah...dai,dimmi che stavi scherzando ! |
|
|
|
|
n/a
deleted
Città: Napoli
10 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 10:43:36
|
| No ho scritto una cosa per un altra .Io la prossima volta starò piu' attenta a quello che scrivo ma tu non ti agitare perchè ti fa male alla salute! |
|
|
|
Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 17:14:30
|
Citazione:
Messaggio inserito da dolceluna85
No ho scritto una cosa per un altra .Io la prossima volta starò piu' attenta a quello che scrivo ma tu non ti agitare perchè ti fa male alla salute!
Ma nooo che non mi agito  ....a me viene da ridere
cmq si, stai piu attenta la prossima volta |
|
|
|
| |
Discussione |
|
Didattica
