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 Disegnare primer per PCR a mano
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marco86
Nuovo Arrivato

Prov.: Novara


6 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 12:01:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marco86 Invia a marco86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho bisogno di un grandissimo aiuto.
Disegnare dei primers senza l'ausilio di software.
Per esempio data una sequenza di x bp, la devo amplificare ed il prodotto di pcr deve essere sotoclonato in un vettore con siti di restrizione.
Se ci sono degli esempi pratici per capire.
Grazie

mark86

GisGis
Nuovo Arrivato

Prov.: TP
Città: Marsala


9 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 13:01:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GisGis  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GisGis Invia a GisGis un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma perchè nn devi usare software?
...intanto io cerco di studiare il tuo caso...
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marco86
Nuovo Arrivato

Prov.: Novara


6 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 17:05:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marco86 Invia a marco86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non posso usare il computer, in quanto sarà un compito d'esame

Ho lasciato anche un altro mex su questo forum, li c'è proprio un probabile testo d'esame. Grazie x l'aiuto

mark86
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 19:24:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mmm...e dov'è il problema???
Io i primer li so disegnare solo a mano!!!
Se la tua sequenza è:

5'-ACTGCTAGCTACGGCATCATGACTCAGATCGACTCAGACTACGACATCTACGACGGCTATCGACGACTACG-3'
3'-TGACGATCGATGCCGTAGA...                               GCCGATAGCTGCTGATGC-5'
Il primer Fw sarà:
5'-TGACGATCGATGCC-3'
ci puoi aggiungere il sito Bam ad esempio GGATCC, e diventa:
5'-GGATCCTGACGATCGATGCC-3'
Un po' più di attenzione devi porre al reverse, poichè devi praticamente leggere la sequenza del filamento di sotto al contrario (5'->3')
quindi:
5'-CGTAGTCGTCGATAGCCG-3'
e alla stessa maniera puoi aggiungere un sito di restrizione, ad esempio EcoRI GAATTC, ed esce:
5'-GAATTCCGTAGTCGTCGATAGCCG-3'

Sono stato chiaro? è difficile?


Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 19:51:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da domi84

Mmm...e dov'è il problema???
Io i primer li so disegnare solo a mano!!!






...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GisGis
Nuovo Arrivato

Prov.: TP
Città: Marsala


9 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 20:14:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GisGis  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GisGis Invia a GisGis un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma tu la sequenza la sai, allora?
perchè sei hai la sequenza il problema è semplicissimo, come già ti è stato mostrato
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Eleo
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


89 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 22:10:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eleo Invia a Eleo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
impara bene a scriverli a mano perchè se finisci in un lab come quello in cui ero io qualche tempo fa ogni cosa deve essere fatta a mano, quindi primer per PCR, per sequenziamento e pure il sequenziamento prima e dopo il clonaggio andava controllato a voce, era davvero patetico! ore a dare le lettere!!!!!
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marco86
Nuovo Arrivato

Prov.: Novara


6 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2008 : 17:12:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marco86 Invia a marco86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un tipo di esercizio l'ho pubblicato in un altra discussione

mark86
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2008 : 17:14:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! anche io li faccio sempre a mano e faccio come ti ha spiegato chiaramente domi
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Cangrande
Utente Junior

Cangrande Della Scala

Prov.: Verona


280 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2008 : 18:07:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Cangrande Invia a Cangrande un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Penso che quasi tutti li facciano a mano e poi i più tecnologici li controllano con i software. A volte mi capita però di farli con i software e poi mi scelgo quello che mi piace di più (e che mi serve d+ !).
I software sono molto utili ma se non si capisce quello che c'è sotto sono inutili!!!

Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala.
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Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2008 : 18:30:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un buon Primer deve avere un'alta specificità , ciò significa:
-Alto contenuto in GC 70-80%
-Lunghezza media dai 18-25 bp
-Non fare Primer Dimer
-Non fare hairping formation
-Avere una specificità unica nel templato

Queste sono le linee base per un buon primer, più è lungo il primer e piu¹ c'è¨ la probabilità di hairping formation.
Oligo è un buon programma, sia per simulazioni di PCR, ma anche per la costruzione dei primer.
Per PCR: Le temperature di melting di annealing vanno teoricamente aggiustate a seconda del primer
Del resto i primer servono da innesco di replicazione, perciò lo puoi costruire a seconda delle esigenze..
Ciao!

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
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Rsr
Nuovo Arrivato


Città: Modena


15 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2011 : 23:02:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Rsr Invia a Rsr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa Domi84 ma penso proprio che hai disegnato i primer in maniera sbagliata.

Innanzitutto le estremità 3' del primer fw e di quello rv devono "guardarsi" in modo che i due terminali delimitino il segmento di DNA da amplificare.

Il primer fw si disegna in maniera COMPLEMENTARE all'elica senso, il reverse a quella antisenso.

Stando alla tua sequenza, il primer fw è:

5'-ACTGCTAGCTACGG-3'

Quello revere:

5'-CGTAGTCGTCGC...-3'.




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