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Discussione |
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brawni
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: Genova
4 Messaggi |
 Inserito il - 02 giugno 2008 : 17:03:00
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Salve a tutti eminenti uomini di scienza. Sono nuovo da queste parti e devo dire che ho trovato veramente utilissimo il forum di questo sito. Bando alle ciance e vi pongo i miei problemi ringraziando in anticipo chi risponderà:
Sto preparando un esame di biofisica per scienze biologiche e mi sono bloccato sui concetti ,diciamo basilari:
Non ho capito bene cosa sia la PSF in relazione alla risoluzione: in particolare cos'è la PSF di eccitazione e quella di emissione?
Inoltre devo preparare un articolo da esporre, ma mi sta veramente facendo penare http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/313/5793/1642
tra le cose che non comprendo c'è questo DLR diffraction limited region..boh. Vi ringrazio per l'attenzione. Ciao!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 02 giugno 2008 : 19:10:04
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| L'articolo non si vede! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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brawni
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: Genova
4 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2008 : 20:12:09
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ah gia bisogna registrasi per vederlo...per postarlo dovrei richiedere un permesso alla rivista, se no ci si può registrare gratis, questione di un attimo  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2008 : 01:13:17
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Conosco l'articolo, molto interessante ma non semplicissimo in effetti.
Per capire il concetto di DLR devi considerare che un qualsiasi sistema ottico (microscopio, telescopio, macchina fotografica etc) è limitato nella sua risoluzione dal cosiddetto limite di diffrazione. Puoi pensare al potere risolutivo di un microscopio come alla minima distanza fra due sorgenti luminose puntiformi alla quale puoi ancora distinguerle come due sorgenti separate. Se le avvicini di più le vedi come un "blob" unico. Per misurare in pratica questa distanza, siccome una sorgente luminosa "puntiforme" esiste solo teoricamente, si usano delle nanosfere ad es. i quantum dots. Quindi se il tuo microscopio ha un limite di diffrazione di 1 micron vuol dire che se hai 2 quantum dots distanti >1 micron riesci a distinguerli come due punti, se sono più vicini ti appaiono come un punto solo.
Il limite di diffrazione dipende da vari fattori, tra cui ovviamente le ottiche del microscopio e la lunghezza d'onda che stai usando. Puoi calcolarlo con il criterio di Rayleigh:
d = 0.61 * l/NA
dove:
l (generalmente si usa lambda ma non abbiamo le lettere greche sul forum...) è la lunghezza d'onda
NA = apertura numerica dell'obiettivo
Una diffraction limited region è una regione del campione i cui punti sono indistinguibili perchè troppo vicini.
Esistono diverse tecniche che ti permettono di sorpassare il limite di diffrazione.
In generale hai due opzioni:
1) usare algoritmi che, generalmente tramite processi di deconvoluzione, ricostruiscono l'immagine. PALM è un esempio di questi metodi.
Un altro metodi è ad es STORM:
Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).
2) Usare delle lenti fatti apposta ad es.
Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens.
Far-field optical superlens.
--------
A questo punto ti dovrebbe essere più chiaro il discorso delle PSF.
La point spread function è una funzione che rappresenta l'intensità di luce di una sorgente puntiforme quando viene guardata attraverso un certo sistema ottico. Come prima, questa è la teoria, in pratica la sorgente di luce non sarà mai puntiforme, avrà sempre una certa dimensione (es. nanoparticella).
Dai una lettura a queste pagine:
http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasresolution.html
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/imageformation/airyna/index.html
Il fatto che tu abbia una PSF di eccitazione ed una di emissione è dovuto alla relazione non lineare tra intensità di eccitazione ed intensità di emissione. In sostanza, se aumenti l'intensità di eccitazione, l'emissione aumenta più che linearmente, "schiacciando" la PSF e quindi aumentando la risoluzione.
Vedi:
Shattering the diffraction limit of light: a revolution in fluorescence microscopy? |
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brawni
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: Genova
4 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2008 : 16:11:51
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ti ringrazio molto per la risposta...scusa ma allora, entrando nello specifico dell'articolo, praticamente dimostrano come ottenere risoluzioni maggiori oltre il DLR utilizzando questo metodo PALM...però non ho capito come funziona |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2008 : 04:18:14
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Allora, vediamo se riesco a spiegartelo in breve.
Innanzitutto parti da un campione in cui hai una proteina fluorescente fotoattivabile (PA-FP). Con questo termine si indica una proteina fluorescente di suo o con un tag fluorescente attaccato che viene solo attivata quando è colpita da una certa lunghezza d'onda. Ad es. la tua proteina può essere fluorescente a 500nm quando eccitata a 380nm, ma SOLO se è stata in precedenza colpita da luce a 300 nm. Le varie proteine saranno molto vicine nella cellula e puoi pensarle come sorgenti puntiformi di luce più vicine del limite di diffrazione.
Quello che si fa è attivare fortemente una piccola % delle molecole, fino a che non sono "bleached" (cioè scolorite, insomma non sono più eccitabili) e prenderne una foto (prima del bleaching ovviamente). Poi attivi un altra piccola % di molecole, ne prendi una foto, poi un'altra piccola % e così via.
Se sommi tutte queste foto ottieni un immagine "sfocata" a causa del limite di diffrazione, equivalente a prendere un'immagine della cellula con una proteina fluorescente normale, non fotoattivabile.
Se però ad ognuna delle foto tu applichi un algoritmo di deconvoluzione, puoi risalire alla posizione esatta della proteina. Questo perchè puoi pensare all'immagine "diffraction limited" come alla convoluzione dell'immagine "puntiforme" della proteina con la PSF del microscopio. Conoscendo la PSF puoi tornare indietro e trovare la posizione della proteina. Il fatto di attivare solo una piccola % di proteine è necessario così per ogni foto avrai solo poche proteine attivate che saranno statisticamente a distanza > del limite di diffrazione. In questo modo la deconvoluzione dà risultati più precisi.
Ora puoi sommare tutte le immagini deconvolute ed ottenere un'immagine con risoluzione maggiore del limite di diffrazione. |
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brawni
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: Genova
4 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2008 : 02:46:49
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| ti ringrazio molto...se incappo in qualche altro guaio magari ti disturbo ulteriormente...grazie |
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Marshepherd
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2013 : 17:13:03
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Ciao a tutti, sto studiando il microscopio e mi sono imbattuto in una perplessità proprio su questa formula:
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
d = 0.61 * l/NA
Allora, sui libri, su internet trovo che il potere risolutivo è direttamente proporzionale a NA e inversamente proporzionale a l
ma questo non è in accordo con questa formula.
Ho capito male o il potere risolutivo aumenta al diminuire della lunghezza d'onda utilizzata e all'aumentare di NA??
quindi la formula dovrebbe essere NA/l
Sicuramente c'è qualcosa che mi sfugge, mi potete aiutare a capire cosa non capisco?
grazie in anticipo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2013 : 20:55:51
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La formula che ho scritto sopra ti serve per trovare il limite di diffrazione.
Più piccolo il limite di diffrazione, più alto è il potere risolutivo in quanto puoi vedere particelle più vicine.
Quindi la formula è assolutamente compatibile con quanto dice il tuo libro: più alta la NA, più piccolo il limite di rifrazione e più alto il potere risolutivo! |
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Marshepherd
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 29 novembre 2013 : 21:32:00
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Ahhhhh ok grazie... dicevo io che mi mancava un pezzo :) |
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microscopia confocale
Didattica e Relazioni
