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Sidus
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9 Messaggi |
 Inserito il - 04 giugno 2008 : 16:06:49
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Non sono molto in chiaro su come vanno usati i diversi metodi di analisi in laboratorio.
In medicina ad esempio per diagnosticare una gravidanza si usa una ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay) con lo scopo di trovare la presenza del chorionic gonadotropin hormone (HCG). Se usassi una cromatografia per affinità potrei in ogni caso diagnosticare una gravidanza? Che cosa non funzionerebbe in caso non andasse bene ?
Faccio questa domanda perchè per ora non ho avuto esperienze di laboratorio, e trovo difficile intuire quando va usata un tipo di analisi piuttosto che un altra.
Lo stesso problema si pone quando devo stimare la massa di una proteina, magari a struttura quaternaria complessa... Come metodi principali nel corso di biochimica ci hanno parlato di gel filtrazione e SDS PAGE (come tipo particolare di elettroforesi).
Poi cercando, ho trovato che la SDS PAGE è precisa al 5-10%... che significa? Che devo prendere i risultati con le pinze?
Aiuto! 
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il sapere rende l'uomo libero. |
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2008 : 20:06:08
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Con un ELISA visualizzi subito la presenza del tuo analita'.
COn la la cromatografia poi devi fare un Western Blot.
Inoltre io mi ricordo che io mio profe di microbiologia mi aveva detto che erano state inventate delle procedure fondate sul stesso princio dell'elisa che sono molto semplici e immadiate molto piu' di fare un western blot che poi non e' proprio cosi' facile se uno non lo a mai fatto. Pensa tipo ad un medico che non e' un biotecnologo....
Beh io quando penso a dover stimare il peso di un proteina penso a un SDS page che ci vuole un'ora e mezza o due (piu o meno), per farlo. Non ho mai pensato di fare una cromatografia. Percio' immagino sia per semplicita'
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2008 : 21:00:57
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| Aspetta, se fai una cromatografia di affinità il western blot dove lo vai a fare? Ottieni un eluato liquido, al massimo ci puoi fare un ELISA...Altrimenti dovresti far correre l'eluato su un gel d'elettroforesi (fai un SDS-PAGE), trasferire le proteine su membrana di nitrocellulosa e fare poi un Western Blot...Il problema è che se hai fatto uan cromatografia d'affinità si presume che tu abbia già soltanto la proteina di tuo interesse, o abbia fatto una scrematura molto grande di tutte le proteine presenti nel campione di partenza, quindi potresti anche colorare il gel e vedere se c'è la tua proteina grazie al confronto con un Protein Ladder...C'è da fare però la distinzione che facendo diluizioni scalari per l'ELISA riesci ad arrivare a un titolo per la proteina che cerchi, cioè riesci diciamo a stimarne la concentrazione, cosa che con l'SDS-PAGE puoi fare solo se fai correre in parallelo dei campioni di una proteina tipo BSA di cui conosci la concentrazione... |
 
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2008 : 10:39:27
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"Ottieni un eluato liquido, al massimo ci puoi fare un ELISA...Altrimenti dovresti far correre l'eluato su un gel d'elettroforesi (fai un SDS-PAGE), trasferire le proteine su membrana di nitrocellulosa e fare poi un Western"
che io sappia beh il Western blot prevede i due passaggi la fase di trasferimento poi si chiama blotting...
"Il problema è che se hai fatto uan cromatografia d'affinità si presume che tu abbia già soltanto la proteina di tuo interesse, o abbia fatto una scrematura molto grande di tutte le proteine presenti nel campione di partenza, quindi potresti anche colorare il gel e vedere se c'è la tua proteina grazie al confronto con un Protein Ladder."
Si effettivamente sprecare anticorpo non avrebbe senso. si risparima tempo.... e soldi
"C'è da fare però la distinzione che facendo diluizioni scalari per l'ELISA riesci ad arrivare a un titolo per la proteina che cerchi, cioè riesci diciamo a stimarne la concentrazione, cosa che con l'SDS-PAGE puoi fare solo se fai correre in parallelo dei campioni di una proteina tipo BSA di cui conosci la concentrazione.."
Beh si potrebbe fare anche semplicemente una analisi allo spettrofotometro...no? o anche con il nanodrop che non ho (scoperto che non serve solo per il dna) In ogni caso quando si carica per fare un sds-page si deve aver gia' quantificato....non ho mai ...visto caricamenti spannometrici se devo essere sincero.
pero' poi ogni lab usa metodiche differenti...
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2008 : 17:39:44
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fondamentalmente si fa un'elisa perchè è decisamente più semplice e meno costoso di una cromatografia di affinità...
l'analisi allo spettrofotometro non puoi farlo su un campione con dentro altre proteine oltra alla tua di interesse perchè fanno interferenza..lo spettrofotometro o il nanodrop li puoi usare per calcolare la concentrazione totale del campione che ti servirà poi per caricare la giusta quantità di prot nella tua sds-page..
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Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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ELISA vs Cromatografia per affinità vs .....???
Didattica
