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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2005 : 15:52:09
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Anche qui ho un problemino...
In laboratorio abbiamo utilizzato il microscopio confocale per risalire alla localizzazione di proteine nelle cellule.
Come esempio, ci è stata spiegata la via PI3K-Akt-mTOR.
In pratica, utilizzando rapamicina come inibitore di mTOR, abbiamo osservato al microscopio a confocale la presenza di Akt totale e di pAkt attiva (cioè fosforilata)nelle cellule grazie a due fluorocromi per le due diverse forme di Akt.(rosso-->pAkt, verde-->Akt)
L'analisi è stata effettuata a intervalli di tempo diverso dall'uso della rapamicina.
All'inizio le due forme erano equivalenti, con pAkt confinato al nucleo, dove agisce.
Poi, il segnale di pAkt aumenta, anche fuori dal nucleo.
Si utilizza anche un terzo colorante: TO-PRO che permette la rilevazione dei nuclei.
Poichè esso è blu, se nel nucleo era presente pAkt, si osservava una sovrapposizione di colori (viola), che indicava la presenza della proteina nel nucleo.
E la conclusione di tutto questo sembrerebbe essere semplicemente che: la rapamicina, inibisce solo mTOR, mentre Akt può benissimo essere fosforilata e attivata...
Tutto questo esperimento è comunque poco chiaro, soprattutto il collegamento con l'utilizzo della rapamicina!
Volevo sapere se qualcuno di voi ha mai fatto un esperimento simile, o comunque, ha capito la finalità di questo!
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2005 : 22:43:38
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Wow! Ma questa era un'esercitazione? Suppongo che pero' il confocale non ve l'abbiano fatto usare personalmente...
Comunque sia, probabilmente ti manca un pezzo di esperimento...
La cosa probabilmente e':
1) stimoli la cellula con qualcosa che attiva la PI3K (ci sono milioni di stimoli che la attivano, quindi non posso immaginare quale abbiate usato!)
2) a questo punto PI3K che e' una kinasi va a fosforilare Akt. Questo lo vedi perche' osservi un aumento di viola (rosso + blu) nella cellula. Fino a qui mi sembra non ci siano problemi.
3) Ora, immagina di non sapere cosa fa la rapamicina. Vuoi vedere se inibisce la fosforilazione di Akt. Metti rapamicina e vedi che comunque c'e' viola => la rapamicina non agisce qui.
Dovresti anche controllare che il verde (=Akt totale) non aumenti/diminuisca in seguito al trattamento.
Ovviamente, questo esperimento, preso cosi, ha poco senso, se non quello di farvi vedere come si usa un confocale.
Per fare le cose per bene si dovrebbe fare:
1) Controllo con stimolo e senza rapamicina guardando Akt e pAkt. (questo ti da il livello base di fosforilazione)
2) Stimolo e rapamicina guardando Akt e pAkt. (questo ti dice che la rapamicina non agisce qui)
3) Controllo con stimolo e guardando mTOR e pmTOR (credo venga fosforilata ma non sono sicuro) con 2 fluorofori diversi (es rosso e verde) + blu x il nucleo. (in questo caso dovresti vedere un aumento di PmTOR)
4) Stimolo e rapamicina guardando mTOR e pmTOR. (qui pmTOR non aumenta).
PS: nota che mTOR vuol dire mammalian target of rapamycin! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2005 : 22:54:00
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Suppongo che pero' il confocale non ve l'abbiano fatto usare personalmente...
Supposizione corretta!
Comunque, ti rigrazio moltissimo per l'aiuto! Sei stato molto gentile! |
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