Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Tecniche
 differenziamento monociti in macrofagi
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

ale83t
Nuovo Arrivato

Prov.: Ferrara
Città: Ferrara


21 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2008 : 16:40:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ale83t Invia a ale83t un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti. sono nuovo del forum e parto subito con una domandona: come posso fare a differenziare i monociti in macrofagi?
innanzitutto premetto che ho cercato qualcosa sia sul forum che su altri protocolli ma ho trovato una eterogeneità enorme di metodi...
ma partiamo dall'inizio: io devo ottenere monociti/macrofagi da un buffycoat, perciò li separo con il ficoll, prendo l'anello e li metto in fiasche da 75 cm3 ad incubare overnight con RPMI 1640 + 20% siero umano, in modo da permettere alle cellule capaci di aderire.
Qui sorge già una domanda: ma teoricamente i monociti non dovrebbero aderire giusto? se non aderiscono, l'unico modo per farli aderire è differenziarli vero?

comunque, una volta fatti aderire scarto il non adeso, lavo con PBS ed incùbo per circa 7 giorni con RPMI 1640+20% siero (ho trovato questo in un articolo) in modo da differenziare i monociti in macrofagi (cambiando terreno ogni 2-3 giorni).
Mi chiedo, c'è un modo più veloce per ottenere macrofagi? i monociti così si differenziano?

E alla fine, come faccio a staccarli dalle fiasche, visto che ho letto in giro che sono difficili da staccare?
grazie mille per le risposte.

buckyVSfuretto
Nuovo Arrivato




1 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2008 : 22:06:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di buckyVSfuretto Invia a buckyVSfuretto un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
io differenzio i monociti a macrofagi dopo 6 giorni di stimolazione con M-CSF; dopo aver fatto il ficoll separo, tramite biglie, i CD14+ in modo da arricchire la mia popolazione in purezza.
I monociti si attivano leggermente e quindi appena piastrati tendono ad aderire ma non come delle vere cellule in adesione.
Spero di essere stata chiara.
V
Torna all'inizio della Pagina

ale83t
Nuovo Arrivato

Prov.: Ferrara
Città: Ferrara


21 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2008 : 22:58:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ale83t Invia a ale83t un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok. grazie.
quindi le cellule che mi ritrovo adese sulla fiasca dopo O.N. di incubazione sono monociti o macrofagi? o entrambi?

nessuno sa come si differenziano con il PMA, se si può fare?
Torna all'inizio della Pagina

Ocean
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2008 : 15:20:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ocean Invia a Ocean un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ale83t

ciao a tutti. sono nuovo del forum e parto subito con una domandona: come posso fare a differenziare i monociti in macrofagi?
innanzitutto premetto che ho cercato qualcosa sia sul forum che su altri protocolli ma ho trovato una eterogeneità enorme di metodi...
ma partiamo dall'inizio: io devo ottenere monociti/macrofagi da un buffycoat, perciò li separo con il ficoll, prendo l'anello e li metto in fiasche da 75 cm3 ad incubare overnight con RPMI 1640 + 20% siero umano, in modo da permettere alle cellule capaci di aderire.
Qui sorge già una domanda: ma teoricamente i monociti non dovrebbero aderire giusto? se non aderiscono, l'unico modo per farli aderire è differenziarli vero?

comunque, una volta fatti aderire scarto il non adeso, lavo con PBS ed incùbo per circa 7 giorni con RPMI 1640+20% siero (ho trovato questo in un articolo) in modo da differenziare i monociti in macrofagi (cambiando terreno ogni 2-3 giorni).
Mi chiedo, c'è un modo più veloce per ottenere macrofagi? i monociti così si differenziano?

E alla fine, come faccio a staccarli dalle fiasche, visto che ho letto in giro che sono difficili da staccare?
grazie mille per le risposte.



Io su una linea di monociti ottenevo il differenziamento trattando con 10ng/ml di PMA per 72 ore!
Torna all'inizio della Pagina

ale83t
Nuovo Arrivato

Prov.: Ferrara
Città: Ferrara


21 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2008 : 16:45:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ale83t Invia a ale83t un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA?
Torna all'inizio della Pagina

Ocean
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 13 giugno 2008 : 09:41:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ocean Invia a Ocean un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ale83t

10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA?

Torna all'inizio della Pagina

Ocean
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 13 giugno 2008 : 09:45:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ocean Invia a Ocean un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ale83t

10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA?



Per il tipo di cell che ho usato (THP-1) la bibliografia consiglia 72 ore. Naturalmente ho provato ad usare tempi inferiori ma i risultati sono stati negativi. Non facevo cambi di terreno, solo dopo le 72h quando dovevo utilizzare le cell.
Anch'io, dopo differenziamento, le stimolavo con PMA: nessun problema se non una mortalità non trascurabile, ma dovuta probabilmente alla trasfezione che precedeva lo stimolo.
Torna all'inizio della Pagina

ale83t
Nuovo Arrivato

Prov.: Ferrara
Città: Ferrara


21 Messaggi

Inserito il - 16 giugno 2008 : 11:58:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ale83t Invia a ale83t un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok. grazie mille per le risposte
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina