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marina1983
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18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2008 : 15:25:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marina1983 Invia a marina1983 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao,
ho un problema con la PCR su cDNA.
ho una coppia di primer che funziona perfettamente sul genomico.
sul cDNA corrispondente a quella parte purtroppo ( altri primer funzionano perfettamente) non funziona. quale altro motivo potrebbe esserci?
forse è una domanda stupida...
grazie
ciao

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2008 : 15:54:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La prima cosa che viene da domandare - per quanto scontata - è :
sei sicuro che i primers annilino su sequenze che vengono trascritte?
(e non, magari, su introni o sequenze intergeniche)

Ovviamente devi accertarti dei siti di appaiamento
e presumo che tu conosca la sequenza del tuo cDNA.

Altra ipotesi: magari è un gene poco espresso.
Prova a caricare quantità maggiori di cDNA (aumento templato disponibile)
oppure quantità minori (riduzione della competizione)
oppure ancora aumentare il numero di cicli, entro un
limite ragionevole per non incorrere in aspecifici.

Ovviamente dovresti prendere in considerazione il fatto che
la retrotrascrizione potrebbe non essere correttamente avvenuta,
e quindi provare con un controllo positivo (di solito si usa amplificare
un gene housekeeping con oligonucleotidi standard).

Se il controllo positivo riesce, ma la tua reazione no,
allora potrebbe darsi che il programma che usi non sia
adatto (tempo di allungamento, temperatura di annealing, ecc.)
Obviously, se non riesce neanche il controllo positivo,
allora ti tocca rifare daccapo la retrotrascrizione.

P.S. hai fatto una retrotrascrizione di controllo RT-
(cioè mix identica, ma senza l'enzima) ?


Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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