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Discussione

darkene
Utente Junior

291 Messaggi

Inserito il - 17 giugno 2008 : 10:28:45

ciao a tutti. sto provando a frazionare nucleo e citoplasma da HeLa usando un kit della Pierce, ma ho trans-contaminazioni in entrambi i versi. qualcuno ha un protocollo testato e pulito?

Pabe
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

15 Messaggi

Inserito il - 18 giugno 2008 : 16:22:52

Noi usiamo questo protocollo e vengono abbastanza puliti:

2x wash pbs
lisi in buffer A (10mM Hepes pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 10mM KCl) 15 min in ghiaccio
vortex 20''
centrifuga 10000 rpm 1' 4�c
Recupero del super (lisati citoplasmatici)
il pellet lo risospendi in buffer B (20mM Hepes pH7.9, 25% glicerolo, 420mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2 mM EDTA) 20 min in ghiaccio
vortex 20''
centrifuga 10000 rpm 10 min
recupera il super (lisati nucleari)

I Buffer vanno complementati prima dell'uso con gli inibitori delle proteasi.

Se puzza � chimica
Se � verde e si muove � biologia
Se non funziona � fisica

darkene
Utente Junior

291 Messaggi

Inserito il - 18 giugno 2008 : 22:12:25

ok, prover�!