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°silvia°
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: genova
100 Messaggi |
 Inserito il - 12 dicembre 2005 : 17:12:49
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ciao, vorrei sapere se qualcuno di voi ha mai estratto il DNA da cellula (io l'ho fatto dal lievito). Che tecnica avete usato? perchè io ho provato due tecniche, una più veloe con l'utilizzo del fenolo e una più lunga senza.
Non mi sembra di aver riscontrato differenze nel risultato.. voi ne avete notate? che tecnica usate?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2005 : 20:02:17
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Hmmm... ok x il fenolo, ma qual'era l'altro metodo?
La tecnica piu' "pulita" e' quella di usare mini-prep o simili, cioe' colonnine ad affinita', veloci e semplici da usare (ma ovviamente piu costose). |
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°silvia°
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: genova
100 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2005 : 16:24:24
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| non trovo il protocollo.. dovrebbe essere quello con il cloroformio e con un alcool.. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2005 : 20:43:04
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| Beh, di solito si estrae con fenolo/cloroformio e poi si precipita con etanolo assoluto. Sinceramente col cloroformio so solo questo metodo... |
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°silvia°
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: genova
100 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2005 : 15:47:22
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| il protocollo l'ho trovato ma è veramente illeggibile.. è una fotocopia chiarissima... cmq è la stessa tecnica usata per estrarre il DNA dai Vibrio ficeri |
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°silvia°
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: genova
100 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2005 : 16:44:37
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ho trovato il protocollo scritto in modo leggibile!!
1. Si preleva 1ml di coltura di lievito in anaerobiosi (quattro giorni di crescita;
2. Si centrifuga per 2 minuti a 14000 rpm;
3. Si butta il sovranatante e si tiene il pellet
4. Si aggiungono 200 #61549;l di Burning buffer ai pellet per la lisi delle membrane;
5. Si incuba con 50 #61549;l proteinasi K (Sigma) per 60 minuti a 37°C;
6. Si aggiungono 200#61549;l di Sevag ( cloroformio e alcool isoamilico in proporzione 24:1);
7. Si ottengono 2 fasi: un sovra con la fase acquosa ed il DNA, ed una fase sottostante contenente il Sevag;
8. A questa soluzione con le due fasi vengono aggiunte 5-10 palline di vetro e si passa al vortex per 5 minuti;
9. Si centrifuga il tutto per 5 minuti a 14000 rpm
10. Si passa nuovamente al vortex per 2 minuti;
11. Si centrifuga nuovamente per 5 minuti a 14000 rpm;
12. Si preleva la fase acquosa (sono circa 200 #61549;l) e la si centrifuga per 5 minuti a 14000 rpm;
13. Si preleva la fase acquosa ( in questo caso dopo la centrifuga il pellet è pochissimo);
14. Si precipita con acetato di sodio ed etanolo. Per prima cosa si aggiungono 25 #61549;l di Na+CH3COO- (Merck) 3M a pH 5.2 e si risospende due o tre volte con la pipetta delicat5amente. Si aggiungono poi 500 #61549;l di etanolo assoluto e si risospende due o tre volte; si noterà così la comparsa di una formazione biancastra corrispondente al DNA;
15. Si mette tale soluzione a –20°c per un’ora;
16. Si centrifuga per 30 minuti a 14000 rpm a 4°C
17. Si ottiene un pellet ed un sovra. Si butta il sovra e si tiene il pellet;
18. Si lava il pellet con 200-500 #61549;l di etanolo al 70% risospendendolo;
19. Si centrifuga per 10 minuti a 14000 rpm;
20. Si elimina l’etanolo e si lascia seccare il pellet per eliminare così tutto l’alcool
21. Si risospende il pellet in 100-200 #61549;l di TE buffer;
22. Si incuba con RNAase (con concentrazione fiunale di 10 #61549;g/ml) per 60 minuti a temperatura ambiente
23. Si leggono i campioni a 230 (sali), 260 (DNA) e 280 ( proteine) nm e se ne fa il rapporto. Per essere attendibile, tale rapporto deve essere maggiore o uguale a 1.8
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2005 : 20:31:23
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| Ah, giusto, l'acool isoamilico! Me lo dimentico sempre... in realta' non ho mai icapito a cosa serve... qualcuno lo usa anche con il metodo del fenolo/cloroformio. Comunque il protocollo piu o meno e' quello... non e' che ci siano molte differenze a parte lo step iniziale! (le colonnine Qiagen sono cmq meglio!) |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2005 : 22:11:27
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Ah, giusto, l'acool isoamilico! Me lo dimentico sempre... in realta' non ho mai icapito a cosa serve... qualcuno lo usa anche con il metodo del fenolo/cloroformio.
Nel metodo fenolo/cloroformio lo si utilizza (rapporto 25:24:1) semplicemente per ridurre la schiuma che si forma durante la reazione. |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2005 : 01:42:35
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Ah ecco! Non si finisce mai di imparare!
Io non l'ho mai usato e l'estrazione ha sempre funzionato benissimo... mi chiedevo a che servisse! |
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°silvia°
Nuovo Arrivato
Prov.: Genova
Città: genova
100 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2005 : 11:36:11
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=) ma in termini di tempo ed efficacia.. quale quindi dei protocolli è il migliore?
Quello delle colonne io non l'ho mai usato.. come è? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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reginella
Nuovo Arrivato
Città: napoli
7 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2011 : 12:47:11
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| ciao a tutti..qualcuno ha un protocollo di estrazione di dna fenolo- cloroformio su sangue.una cosa dettagliata,con la spiegazione dei vari passaggi...grazie! |
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tecniche di estrazione di DNA
Didattica e Relazioni
