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frau_frosch
Utente Junior
Città: Boston
225 Messaggi |
 Inserito il - 25 giugno 2008 : 21:23:19
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Non facciamo confusione. La microiniezione del DNA è una tecnica che permette di iniettare piccole quantità di DNA in singole cellule. La fecondazione in vitro (IVF) non utilizza micromanipolazione ma semplicemente coincuba spermatozoi capacitati e ovociti allo stato di metafase II. Al massimo potresti usare un micromanipolatore per iniettare uno spermatozoo in modo intracitoplasmatico (ICSI) o uno spermatidio (ROSI/ELSI).
Al contrario, esempio classico di applicazione della tecnica di microiniezione del DNA è la transgenesi tramite iniezione pronucleare per ottenere animali transgenesi.
In generale la tecnica prevede l'utilizzo di un micromanipolatore, che si compone di un "normale microscopio" (puoi usare un microscopio a fluorescenza, ad esempio) al quale sono collegate due staffe, una per lato. La staffa di sinistra regge l'holding needle, ossia un ago cavo all'interno (diametro interno di circa 40 micron);la staffa di destra regge l'injection needle, che può avere dimensioni diverse a seconda della tecnica: per la ICSI 7 micron, per la ROSI 15, per il prelievo di blastomeri 20 etc..non ho mai fatto microiniezioni ma suppongo che l'injection sia da 5 micron o meno.
Questi aghi possono essere spostati dall'operatore con dei joystick: per ogni ago ci sarà uno per il macromovimento (ad esempio alzare ed abbassare l'ago o per spostamenti grossolani) e uno per il micromovimento (per spostarsi nel campo osservato al microscopio). Sempre tramite il joystick si può aspirare o iniettare: ciò dipende da un sistema idraulico che sfrutta un liquido presente negli aghi (solitamente paraffina liquida). Nel caso dell'injection needle per la micriniezione di DNA suppongo che non ci sia paraffina, per evitare di inserirne nella cellula, ma ripeto non è una tecnica che ho mai effettuato personalmente!
Nel caso dell'applicazione in trangenesi (microiniezione in pronucleo) si agisce iniettando il costrutto transgenico in un pronucleo. Ciò chiaramente richiede uno zigote, per cui in realtà la prima cosa da fare è ottenerlo a partire da ovociti maturi e spermatozoi. Solitamente si usa la ICSI a questo scopo: si tiene fermo l'ovocita sull'holding esercitando una lieve aspirazione e si inietta lo spermatozoo, precedentemente prelevato con l'injection, nel citoplasma.
Dopo una coltura variabile (in bovino può rihciedere 24-26h) si ha lo zigote, riconosciuto dalla presenza di un secondo globulo polare estruso e dei 2 pronuclei nel citoplasma: a questo punto, tenendo fermo con l'holding lo zigote, si inietta nel pronucleo il costrutto prelevato ocn l'injection. Si osserva una lieve espansione del pronucleo scelto.
A questo punto ci si aspetta che il costrutto vada ad integrarsi nel genoma pronucleare e che questa inserzione determini l'espressione del gene senza che l'inserzione determini morte cellulare o comunque una mutagenesi inserzionale.
I limiti della tecnica, oltre a tutti i limiti dervianti da tale mutagenesi, consistono nella imprevedibilità dello stadio al quale il costrutto verrà integrato: infatti idealmente ciò dovrebbe accadere a livello di zigote, ma potrebbe avvenire in seguito, dando origine ad un embrione mosaico che potrebbe anche presentare integrazione del gene in cellule che daranno annessi embrionali e non il feto vero e proprio.
Spero di esserti stata utile e mi scuso se non posso dirti di più...la mia risposta è abbastanza "accademica"!!! Magari qualcuno aggiugerà altro però ;) |
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Microiniezione
Didattica e Relazioni
Inserito il - 26 giugno 2008 : 21:38:31
