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Ale SS
Nuovo Arrivato

Prov.: Sassari


31 Messaggi

Inserito il - 05 luglio 2008 : 18:49:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ale SS Invia a Ale SS un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao
Sapete dirmi qualcosa su:
1) Immunodosaggio competitivo (RIA)
2) Dosaggio immunometrico (IRMA)

giusto qualcosa in generale...



Grazie

virginia84
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 06 luglio 2008 : 18:50:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di virginia84 Invia a virginia84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
negli anni ’70 è stato messo a punto un metodo per dosare la renina circolante tramite la misura della sua attività enzimatica: PRA (Plasma Renin Activity:). In pratica, si misura con metodo RIA la quantità di Angiotensina I generata per azione della renina(renina da parte dell’apparato juxtaglomerulare del rene sono: -la concentrazione del sodio nel tubulo distale: le cellule della macula densa registrano le variazioni del carico di sodio nel tubulo, per cui un aumento della concentrazione inibisce la secrezione di renina, una diminuzione, invece, la stimola) sull’angiotensinogeno, dopo incubazione del campione, per un periodo variabile da 1 a 3 ore, in condizioni controllate di temperatura e di pH (5.4–5.7, 6.0, secondo altre metodiche). La concentrazione di Angiotensina I nel plasma, alla fine dell’incubazione, è dell’ordine di alcuni ng/mL,
cioè mille volte superiore a quella fisiologica e quindi nell’intervallo di sensibilità di un RIA convenzionale. Poiché la generazione di Angiotensina I è in funzione della quantità di plasma utilizzato e della durata dell’incubazione i livelli di PRA devono essere riferiti in ng/mL/h. Il metodo RIA consiste, come è noto, in una competizione che si instaura tra antigene marcato (tracciante radioattivo) ed antigene non marcato (standard, campione) a
legarsi ad un numero limitato di siti leganti specifici
sull’antisiero adeso alle provette. Dopo l’incubazione il liquido contenuto nelle provette viene eliminato e le provette contate in un gamma counter. La radioattività ottenuta per ciascuno standard o campione, è inversamente proporzionale alla quantità di ormone presente nel campione. La necessità di un bianco (incubato a 4°C) per ogni campione (incubato a 37°C), (l’incubazione è
effettuata in presenza di un inibitore enzimatico, che blocca l’azione dell’ACE nonchè delle angiotensinasi, ma non quella della renina, per evitare la
degradazione enzimatica dell’Angiotensina I) e del rispetto rigoroso dei tempi di incubazione rende il dosaggio complesso, soprattutto se applicato a
grandi serie di campioni. La stessa fase preanalitica si presenta cruciale; il prelievo deve essere effettuato mediante siringa e con provetta
prerefrigerata, trasportato in bagno di ghiaccio, il plasma deve essere immediatamente separato in una centrifuga refrigerata, e successivamente va
rapidamente congelato. In uno studio, circa il 70% dei casi di incongruenza tra dato analitico e situazione fisiopatologia era dovuto ad una gestione
non corretta della fase preanalitica. Infine, il fattore intrinsecamente limitante del dosaggio del PRA è il livello di angiotensinogeno plasmatico; in caso
di patologie in cui questo sia basso (epatopatie, cirrosi, scompenso cardiaco congestizio) si possono riscontrare valori di PRA sottostimati, rispetto al
reale tasso di renina attiva, mentre si ha al contrario una sovrastima del PRA in casi di pazienti con angiotensinogeno elevato (gravidanza,
contraccettivi orali, estrogenoterapia, corticoterapia, etc.). Un metodo alternativo per quantificare la renina è quello di misurarla direttamente,
utilizzando anticorpi di adeguata specificità; anni fa, questo non è era possibile, perché gli anticorpi policlonali disponibili non distinguevano la forma
attiva da quella inattiva dell’enzima. Successivamente sono stati ottenuti anticorpi monoclonali, cioè capaci di interagire con un singolo epitopo
immunologicamente determinante, specifici sia per la renina attiva che per quella inattiva, con i quali è stato possibile allestire una metodica IRMA.
Precedentemente (1), questa tecnica prevedeva una prima fase di incubazione del plasma con una sospensione di ossido ferroso adeso a particelle di
poliacrilamide agarosio, su cui era adsorbito un primo anticorpo monoclonale in grado di riconoscere sia la renina attiva che quella inattiva. Dopo l’incubazione i complessi renina-antirenina formatisi venivano separati dal supernatante grazie all’uso di barre magnetiche e risospesi in una soluzione
tamponata contenente un secondo anticorpo radiomarcato con Iodio125, specifico per la forma attiva. Si formavano così dei complessi a “sandwich”,che, dopo l’allontanamento del tracciante in eccesso venivano quantificati mediante la misura della radioattività residua, direttamente proporzionale al loro numero.
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Ale SS
Nuovo Arrivato

Prov.: Sassari


31 Messaggi

Inserito il - 07 luglio 2008 : 16:27:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ale SS Invia a Ale SS un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcosina in generale?

Comunque grazie mille!
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Dacrua
Nuovo Arrivato

Sailor

Città: Lucca


41 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 15:25:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dacrua  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dacrua Invia a Dacrua un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti metto tutto quello che ho trovato...

ARGOMENTO: DOSAGGIO IMMUNOCHIMICO

Premessa - E' possibile ottenere il dosaggio di un antigene utilizzando metodi quali l'immunodiffusione e l' immunoelettroforesi bidimensionale. Al giorno d'oggi, tuttavia, la tendenza generale e' quella di impiegare metodi nei quali l'antigene o l'anticorpo sono immobilizzati su fase solida e quindi il rilevamento del legame antigene-anticorpo viene eseguito con altri metodi che non siano la misurazione diretta di un precipitato insolubile. A dire il vero, un' immunopreciptazione viene effettuata correntemente anche al giorno d'oggi nell' analisi nefelometrica, ma essa avviene in fase libera (non in gel) e la lettura effettuata con metodo strumentale (vedi scheda: Metodologie immunochimiche speciali). In ogni caso, grande rilievo viene dato attualmente a tecniche quali l' ELISA, il RIA, ecc. Il vantaggio di questi metodi e' dato dalla sensibilita' molto maggiore, dalla semplicita' di impiego, dalla misurazione strumentale e, infine, dalla possibilita' di utilizzare sia anticorpi policlonali che monoclonali. Quest’utimi, pur essendo molto specifici, non possono essere utliizzati nelle reazioni di immunprecipitazione, non essendo in grado di formare un reticolo, tranne che in qualche particolare situazione. Essi, infatti, riconoscono normalmente un singolo epitopo nell'ambito dell' Ag e quindi possono formare solo immunocomplessi costituiti da un Ab piu' due molecole di Ag . Fanno eccezione i monoclonali IgM diretti contro un Ag in cui l'epitopo sia ripetuto nella molecola (ad es. un polimero). Prima di entrare nel vivo dell' argomento, conviene chiarire il significato di alcuni dei numerosi acronimi che indicano tecniche diverse ma che spesso sono sinonimi o variazioni dello stesso metodo. Alcuni di queste tecniche sono rivolte all'analisi clinica e quindi dedicati alla ricerca di antigeni con significato diagnostico o di anticorpi specifici diretti contro patogeni nelle malattie infettive, contro allergeni nelle forme allergiche, strutture self nelle malattie autoimmuni, ecc.

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

RIA: Radio Immuno Assay

IRMA: ImmunoRadioMetric Assay

EMIT: Enzyme-Multiplied Immunoassay

RIST: Radio ImmunoSorbent Test

RAST: RadioAllergoSorbent Test

I traccianti - Come accennato in precedenza, le metodiche in questione evidenziano la reazione primaria tra un anticorpo ed il relativo antigene, mediante traccianti (marcatori) quali: 1. Enzimi; 2. Fluorocromi; 3. Radionuclidi. Nel primo caso, la presenza di enzimi quali la perossidasi, la fosfatasi alcalina e la #61538;-galattosidasi) viene rivelata mediante substrati cromogeni. Il colore formatosi viene dosato con metodo spettrofotometrico valutandone l'assorbanza ad un' opportuna lunghezza d'onda. Nel secondo caso, i fluorocromi emettono luce nel visibile se eccitati da radiazione UV; nel terzo, la radioattivita' di radioisotopi quali lo Iodio 125 e' rilevata da contatori di emissioni radioattive. Una piu' precisa descrizione dei marcatori e delle loro condizioni di impiego e' riportata nella scheda relativa a: Immunocitochimica.

Secondi anticorpi - Molte delle reazioni di dosaggio prevedono l'uso di secondi anticorpi. Sono questi degli antisieri policlonali diretti contro gli anticorpi oggetto della reazione primaria contro l'Ag. Ad esempio, se il primo anticorpo e' stato prodotto in coniglio, i secondi anticorpi sono stati ottenuti in pecora (capra, asino, ecc.) iniettando anticorpi di coniglio. I secondi Ab vengono abitualmente coniugati con il tracciante ed il loro uso e' consigliabile quando il primo Ab e' particolarmente costoso (ad esempio un Ab monoclonale) e la sua coniugazione non conveniente, oppure quando si vuole ottenere una ulteriore amplificazione della risposta. Questo avviene in quanto per ogni interazione tra Ab primario ed Ag legano piu' Ab secondari aumentando il numero di molecole del marcatore. L'uso di anticorpi secondari implica un ulteriore passaggio nella metodica e quindi nei dosaggi esso viene evitato quando possibile. L'uso dei secondi anticorpi e' molto piu' frequante nelle reazioni immunocitochimiche, come si vedra' nella scheda relativa.

Contenitori e immobilizzo di molecole - Per le reazioni di dosaggio relative alle tecniche sopra accennate viene utlizzata una varieta' di contenitori, in genere di materiale plastico come il polistirene ed polivinilcloruro (PVC). Questi polimeri si prestano particolarmente all'adsorbimento di Ag o di Ab, qualora cio' sia richiesto dalla metodica. In altre parole, la plastica ha la capacita' di trattenere molecole proteiche se queste vengono aggiunte al contenitore in una soluzione tampone bicarbonato 100 mM a pH 9 e ad una concentrazione intorno a 10 #61549;g/ml. I meccansimi di adsorbimento non sono ancora chiari, anche se probabilmente sono le interazioni idrofobiche a stabilizzare il legame. Il recipiente di piu' largo impiego e' la piastra da microtitolazione a 96 pozzetti, in ciascuno dei quali si fa avvenire una singola reazione.

IL TEST RIA
Il Test di radioimmunoassay e' largamente impiegato nel dosaggio di apteni (ormoni steroidi, farmaci, ecc.). Nella sua formulazione classica esso viene eseguito in fase liquida, ed il complesso Ab/Ag che si forma viene precipitato artificialmente con aggiunta di Polietilenglicol, acetone, ecc. Il metodo, schematizzato in FIG. 1, consiste nel porre in


FIG. 1

competizione una quantita' fissa di Ag* marcato con radioisotopi (ligando radioattivo) con quantita' ignote di Ag freddo da dosare (ligando competitore) per il legame con una quantita' fissa di Ab. Quantita' crescenti di Ag freddo determineranno una progressiva diminuzione dell' Ag* legato agli Ab, secondo la reazione:

4 Ag* + 4 Ab ===== 4 Ag*Ab

4 Ag + 4 Ag* + 4 Ab ===== 2 Ag*Ab + 2 AgAb + 2 Ag* + 2 Ag

12 Ag + 4 Ag* + 4 Ab ===== Ag*Ab + 3 AgAb + 3 Ag* + 9 Ag

ecc.

Aggiungendo quantita' note di Ag competitore si puo' costruire una curva di taratura (FIG. 2) utilizzata per calcolare la concentrazione incognita di un Ag mediante interpolazione del valore ottenuto.

FIG. 2

IL TEST ELISA
Il test ELISA e' un tipico saggio a sandwich in cui gli Ab vengono previamente adsorbiti sul supporto plastico. Alle piastre cosi' preparate viene aggiunto l'Ag e quindi un secondo anticorpo diretto sempre contro l'Ag e coniugato con un enzima. L'aggiunta di un substrato cromogenico, dopo lavaggio dell'eccesso di anticorpo secondario, sviluppa un colore la cui intensita' e' direttamente proporzionale alla quantita' di Ag immobilizzato (FIG. 3). Anche in questo caso, il dato ottenuto con l'Ag incognito viene paragonato a quelli di quantita' note.





IRMA, EMIT, RIST e RAST
Questi metodi devono ritenersi varianti dei due metodi sopra descritti. L' IRMA differisce dal RIA per il fatto che e' l'anticorpo ad essere iodinato e non l'Ag. Nell'EMIT, l'Ag di riferimento e' direttamente coniugato con un enzima e l'interazione con l'Ab determina l'inattivazione dell'enzima. La presenza di Ag competitore determina provoca un aumento dell' attivita' enzimatica con un andamento simile a quello descritto per il RIA. RIST e RAST sono due metodi radiometici che val la pena ricordare perche' sono indirizzati al dosaggio di IgE dirette contro particolari allergeni. Come riportato nella scheda relativa alla classificazione degli anticorpi, le IgE sono immunoglobuline la cui sintesi avviene in risposta agli Ag coinvolti nelle risposte allergiche. Il titolo serico delle IgE e' comunque molto basso e necessita di metodi di dosaggio molto sensibili. Gli allergeni utIlizzati nel saggio vengono appositamente purificati e comprendono centinaia di sostanze, principalmente pollini.


= Francesca =
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