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biokiu
Nuovo Arrivato

pollon


30 Messaggi
Inserito il - 07 luglio 2008 : 08:53:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biokiu  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biokiu Invia a biokiu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti! devo progettare due primer per amplificare questa sequenza e creare due siti di restrizione per EcoRI all'inizio e BamHI alla fine.

5’ATGAAACCAT TCTTCCTCAT TTCGCTGCTG GTCACGGTCT TCATGAGCCT
CATGTTGGCC ACCACCGCTC AACCCAGCCT TCCACTCAAC AACCGGCGGG
AACTTGCTGA GCATCCCCCA GTCAAGGGTA ACCCCCCAAA CACCGGCTAT
GCACTAGACT GGTGCAAATA CACAGCCGGA ATGCTATTTC AGTGGGATCT
CCCGACGTTT ATCAAGCATC GCGAGGCAAA CTTCAGCCTC GGACGGCTGA
CGTGGGACTG GTCGTCGGAT GGGTGTACCC ACGTCCCGGA CAATCCGGTT
GGCTTCCCAT TCAAGCCGGC GTGCCAGCGT CACGACTTTG GATACCGGAA
CTACCAGGTC CAATTCCATT TTACCCCGCG TGCTAGATGG AAGATTGACG
AGAATTTCCT CAAAGACATG AAATTCCAGT GCATAGGGCA CAACATCTTC
AATGCCTGCC ACTTCATGGC ACATGTTTAT CATTGGGGAG TCCGAACCTT
CTATAAAGGC CATGAGCAAT ACCGTGAGAG TGAGCCGTCT CACAAGATGA
TGGACACGAT GGTCGCTTCT GAATCGTCGG ACGTGTTTGA TGGGATGGAC
GCCGATGAAG CGAGGGACGC TCTCAATCCA TATCTTTCTG AAGAGAAGAC
CAAAGAGTAC TACGATCGTG CCCTAGCGCG TTACAACAAG TGTGTTGAGG
AAGCCATGGC GCAAGGCATT GACCTTCAGA AATACTGGGC CGCTTTTTAG 3’



mi aiutate per favore? grazie!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 07 luglio 2008 : 15:00:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh immagino che tu debba amplificare la sequenza intera, quindi non ti resta altro che disegnare i primer complementari all'inizio e alla fine della sequenza e aggiungre alle estremità i siti di restrizione.
Primer Forward: 5'- sito per EcoRI + sequenza "iniziale" - 3'
Primer Reverse: 5'- sito per BamHI + sequenza "finale" (complementare, invertita)- 3'
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biokiu
Nuovo Arrivato

pollon



30 Messaggi
Inserito il - 07 luglio 2008 : 15:15:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biokiu  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biokiu Invia a biokiu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
però in questo modo il primer reverse ha il 50% di CG, mentre l'altro no. non dovrebbero avere una stessa Tm?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 07 luglio 2008 : 18:05:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io non mi sono messa a guardarli, comunque ne puoi fare uno più lungo e uno più corto in modo da avere una temperatura di melting simile o puoi aggiungere della altre basi prima o dopo la sequenza per gli enzimi di restrizione, purchè la parte che sia appaia al tuo stampo non diventi poi troppo corta!
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Gabriele
Utente

Prov.: Pisa
Città: Pisa


615 Messaggi
Inserito il - 07 luglio 2008 : 21:03:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gabriele Invia a Gabriele un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Attento a BamHI, è un enzima molto poco efficiente. Aumenta i tempi di digestione rispetto a quelli consigliati, è un suggerimento che mi sento di darti. E ricontrolla sempre risultati "sospetti".
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe."
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biokiu
Nuovo Arrivato

pollon



30 Messaggi
Inserito il - 11 luglio 2008 : 14:27:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biokiu  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biokiu Invia a biokiu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie! ho allungato e la temperatura è simile, sembra che vada bene.o almeno spero!
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