Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

crischi
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 17:26:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di crischi Invia a crischi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti mi chiamo cristina,
ho un problema e non riesco a risolverlo.....non riesco a fare un clonaggio...l'unico risultato che ho sono dei plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina ......nelle piastre si presentano colonie molto piccole, dallo screening ovviamente non si capisce niente.....non sono ricchiusi .....crescono in terreno con kana ma sul gel d'agarosio non c'è nessuna banda...
cosa puo? essere?
una contaminazione? di che?


aiutatemi

lunissima
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


6 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 20:10:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lunissima Invia a lunissima un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Potrebbe essere che hai(ad esempio nelle pipette) un plasmide contaminanteche che porta anch'esso la resistenza alla kanamicina! Così i batteri sono resistenti e crescono su terreno selettivo ma analizzi le colonie per restrizione o per PCR non viene fuori nessuna banda!!!
Alternativamente se queste colonie negative sono molto più piccole del normale potrebbe essere che si è rovinato l'antibiotico ma questo lo vedi bene da quello che cresce sulla piastra di controllo in cui piastri i batteri non trsformati!
Torna all'inizio della Pagina

Clivi
Nuovo Arrivato




22 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 20:35:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Clivi Invia a Clivi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao...io purtroppo non posso esserti utile ma avrei bisogno di capire un problema inerente...
qual'è la differenza tra selezione positiva e negativa in lievito...mi aiutate a capirla?
Se per esempio ho il gene URA3, il cui inibitore è il FOA, cosa avrò nei ceppi URA3+? e nei ceppi URA3-? perchè i ceppi URA3- sono resistenti al FOA?
Un grazie in anticipo!
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 22:54:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Clivi

Ciao...io purtroppo non posso esserti utile ma avrei bisogno di capire un problema inerente...
qual'è la differenza tra selezione positiva e negativa in lievito...mi aiutate a capirla?
Se per esempio ho il gene URA3, il cui inibitore è il FOA, cosa avrò nei ceppi URA3+? e nei ceppi URA3-? perchè i ceppi URA3- sono resistenti al FOA?
Un grazie in anticipo!

Beh non mi sembra sia inerente , forse era meglio aprire una discussione a parte...
Comunque:
Il gene URA3 codifica per la orotidina-5’-fosfato decarbossilasi che è un enzima importante per la via biosintetica dell’Uracile.
Ceppi URA3- saranno incapaci di sintetizzare uracile e quindi non possono crescere su terreno privo di uracile (o uridina) --> selezione positiva

Ma la orotidina-5’-fosfato decarbossilasi converte anche il 5-FOA (acido 5-fluoroorotico) in 5-fluorouracile che è un composto tossico per le cellule (è un analogo della pirimidina).
Se ceppi URA3+ vengono fatti crescere su terreno contenente 5-FOA non saranno in grado di sopravvivere --> selezione negativa

Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:03:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da crischi

Ciao a tutti mi chiamo cristina,
ho un problema e non riesco a risolverlo.....non riesco a fare un clonaggio...l'unico risultato che ho sono dei plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina ......nelle piastre si presentano colonie molto piccole, dallo screening ovviamente non si capisce niente.....non sono ricchiusi .....crescono in terreno con kana ma sul gel d'agarosio non c'è nessuna banda...
cosa puo? essere?
una contaminazione? di che?


aiutatemi



Ciao Cristina, innanzitutto benvenuta sul forum!
Per quanto riguarda la tua domanda, non ho capito bene le questione.
Cosa sarebbero i plasmidi non plasmidi? Cosa vorrebbe dire che non sono richiusi? Che analisi hai fatto? PCR, restrizione?
Per il resto potrebbe essere come ha detto lunissima.
Hai già lavorato con altri plasmidi che dessero resistenza alla kanamicina? Hai utilizzato le stesse pipette?
Torna all'inizio della Pagina

pistilin
Nuovo Arrivato


Città: Napoli


9 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:10:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pistilin Invia a pistilin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao,
prima di tutto controlla dalla mappa di restrizione del vettore in cui cloni ke sia effettivamente resistente alla Kana...e solo x quello...
poi controlla la bontà del tuo antibiotico...magari è scaduto..
oppure può essere ke la ligasi nn ha funzionato(o per l' enzima o per il buffer) e nn hai inserito nessun farmmento....
io ho avuto il tuo stesso problema con il mio clonaggio e alla fine ho scoperto ke il plesmide nn era realmete resistente alla Kana....sono impazzita x due mesi
e per risolvere feci tutte queste prove...
spero esserti stata utile
ciao
Torna all'inizio della Pagina

Clivi
Nuovo Arrivato




22 Messaggi

Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:16:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Clivi Invia a Clivi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie GFPina...hai ragione...mi sono accorta troppo tardi che non era lo stesso argomento!
Ad ogni modo ora mi è chiara la differenza! Grazie per la risposta!
Torna all'inizio della Pagina

crischi
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2008 : 10:06:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di crischi Invia a crischi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Messaggio inserito da lunissima
Potrebbe essere che hai(ad esempio nelle pipette) un plasmide contaminanteche che porta anch'esso la resistenza alla kanamicina! Così i batteri sono resistenti e crescono su terreno selettivo ma analizzi le colonie per restrizione o per PCR non viene fuori nessuna banda!!!
Alternativamente se queste colonie negative sono molto più piccole del normale potrebbe essere che si è rovinato l'antibiotico ma questo lo vedi bene da quello che cresce sulla piastra di controllo in cui piastri i batteri non trsformati!


le analisi che ho fatto sono per PCR...ho usato degli oligo esterni che mi hanno fatto capire che non è un richiuso...invece gli oligo interni mi hanno fatto capire che non c'è l'inserto...dalla PCR non viene fuori nessuna banda.
per quanto riguarda l'antibiotico non credo sia scaduto anche perchè viene usato anche dai miei colleghi che non hanno problemi...e poi mi succede anche con un altro vettore che ha la resistenza alla tetraciclina
Torna all'inizio della Pagina

crischi
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2008 : 10:25:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di crischi Invia a crischi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Ciao Cristina, innanzitutto benvenuta sul forum!
Per quanto riguarda la tua domanda, non ho capito bene le questione.
Cosa sarebbero i plasmidi non plasmidi? Cosa vorrebbe dire che non sono richiusi? Che analisi hai fatto? PCR, restrizione?
Per il resto potrebbe essere come ha detto lunissima.
Hai già lavorato con altri plasmidi che dessero resistenza alla kanamicina? Hai utilizzato le stesse pipette?
[/quote]

grazie
io gli definisco plasmidi non plasmidi......per non chiamarli mostri.....perchè se metto queste colonie che, crescono in terreno con kana, in coltura e poi estraggo il dna plasmidico, dal gel non si vede nessuna banda.
quello che uso è un vettore che normalmente viene usato nel nostro laboratorio e che non ci dà tutti questi proplemi....è anche vero che ogni tanto, a turno, abbiamo questi problemi......ho cambiato tutti i buffer e le ligasi...l'unica cosa che mi resta da fare e pulire tutto nuovamente e cercare di sterilizzare le mie pipette!!!!!


speriamo bene
grazie
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina