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fede.84
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
 Inserito il - 24 luglio 2008 : 22:12:29
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Ciao a tutti! Ultimamente ho problemi con i miei western blot. Le bande fino a circa 50 kDA sono dritte, poi al di sotto diventano tutte sbavate e ondulate (tipo elettrocardiogramma). Sono davvero disperata, ho combiato tutti i reagenti, ho stretto di più il sandwich mettendo più spugne, ma non è servito a niente....a cosa può essere dovuto? L'ultima volta ho caricato 20 microgrammi di proteina, ho corso tutto il gel a 250 V e 10 mA e ho iniziato il blot nel pomeriggio, fino alla mattina dopo. Il blot lo faccio a 75mA e 30V.
Può essere il laemly? Il running? La velocità di corsa? io uso un 10x che diluisco ogni volta...
Vi ringrazio per i consigli che spero mi darete!!! :)))
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 24 luglio 2008 : 23:04:06
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prova a far correre a 200 V costanti e a fare il trasferimento a 80 mA costanti (voltaggio massimo).
Al massimo prova ad usare un transfer con più metanolo (20X)...ciao |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2008 : 01:09:40
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io la corsa la faccio a 100 V..200 e 250 V mi sembrano elevati..secondo me cmq il problema sta nel gel più che nel resto..controlla i reagenti per preparare il gel..è l'unica cosa che mi viene in mente perchè credo che tu non abbia cambiato modo di preparazione..
ps. ovviamente il mio discorso cade se usi i precasted.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2008 : 10:36:26
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sono d'accordissimo con nyo, non è un problema di trasferimento ma di corsa. per toglierti il dubbio, colora un gel con blu comassie per un'oretta e vedi come sono le bande. volendo azzardare un'ipotesi, credo che non sia neanche colpa del gel in sè, altrimenti i pesi superiori a 50 kDa dovrebbero distorcersi allo stesso modo, ma penso che sia un problema di camera, come severso il fondo del gel non si chiudesse bene, causando un un po' di dispersione di corrente che ti altera la corsa. prova a cambiare apparato e colora con comassie, non sbatterci la testa più di tanto sul trasferimento, non è quello il problema 
facci sapere.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2008 : 23:44:36
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| la penso come iside...penso proprio sia un problema di camera. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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fede.84
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:15:39
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Eccomi qua! I western che ho fatto ieri e oggi erano perfetti! Di nuovo ho rifatto il laemly che era vecchissimo e ho fatto il blot di tre ore anzichè overnight! Il gel l'ho corso a 150V e 25mA...
Dite che possa essere una di queste cose?
La camera non ho potuto cambiarla, era l'unica che avevo!!
grazie comunque dei vostri consigli!! |
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fede.84
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:22:27
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| Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sì, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:56:18
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Citazione:
Messaggio inserito da fede.84
Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sì, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!!
Se usi la funzione "cerca" con un po' di pazienza trovi una discussione in cui se n'è già parlato.
Io li avvolgo in carta bagnata + carta stagnola e li conservo a 4 gradi fino a 5 giorni!
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 08 agosto 2008 : 11:36:46
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io di solito colo solo il lower e sopra ci metto l'acqua.
poi lo metto a 4°C, e quando mi serve ci colo sopra l'upper |
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 08 agosto 2008 : 15:49:43
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Citazione:
Messaggio inserito da fede.84
Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sì, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!!
preparo separating e stacking, impacchetto in carta bagnata con acqua e pellicola di plastica e lascio a 4°C x max 7gg. Alcuni miei colleghi tolgono addirittura già il pettine e apparentamente i pozzetti si mantengono "in forma" senza problemi! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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Deimos
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
Città: Pavia
2 Messaggi |
Inserito il - 27 agosto 2008 : 16:25:11
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Anche secondo me il problema era nel voltaggio troppo elevato e relativo surriscaldamento. Io personalmete vado ad amperaggio costante aumentoandolo progressivamente una volta superato lo Stack fino ad un massimo di 30mA. Il tempo dipende dalla concentrazione della Poliacrilamide ma generalmente non più di un'ora e mezza.
Saluti |
Deimos the Western Magician |
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Problemi western blot!!
Didattica
