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 Problemi western blot!!
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fede.84
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2008 : 22:12:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fede.84 Invia a fede.84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! Ultimamente ho problemi con i miei western blot. Le bande fino a circa 50 kDA sono dritte, poi al di sotto diventano tutte sbavate e ondulate (tipo elettrocardiogramma). Sono davvero disperata, ho combiato tutti i reagenti, ho stretto di pił il sandwich mettendo pił spugne, ma non č servito a niente....a cosa puņ essere dovuto? L'ultima volta ho caricato 20 microgrammi di proteina, ho corso tutto il gel a 250 V e 10 mA e ho iniziato il blot nel pomeriggio, fino alla mattina dopo. Il blot lo faccio a 75mA e 30V.
Puņ essere il laemly? Il running? La velocitą di corsa? io uso un 10x che diluisco ogni volta...
Vi ringrazio per i consigli che spero mi darete!!! :)))

paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Cittą: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2008 : 23:04:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova a far correre a 200 V costanti e a fare il trasferimento a 80 mA costanti (voltaggio massimo).
Al massimo prova ad usare un transfer con pił metanolo (20X)...ciao
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nyo84
Utente Junior


Prov.: Brescia
Cittą: Piancogno


239 Messaggi

Inserito il - 25 luglio 2008 : 01:09:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nyo84 Invia a nyo84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io la corsa la faccio a 100 V..200 e 250 V mi sembrano elevati..secondo me cmq il problema sta nel gel pił che nel resto..controlla i reagenti per preparare il gel..č l'unica cosa che mi viene in mente perchč credo che tu non abbia cambiato modo di preparazione..

ps. ovviamente il mio discorso cade se usi i precasted..

Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa...
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Cittą: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 25 luglio 2008 : 10:36:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sono d'accordissimo con nyo, non č un problema di trasferimento ma di corsa. per toglierti il dubbio, colora un gel con blu comassie per un'oretta e vedi come sono le bande. volendo azzardare un'ipotesi, credo che non sia neanche colpa del gel in sč, altrimenti i pesi superiori a 50 kDa dovrebbero distorcersi allo stesso modo, ma penso che sia un problema di camera, come severso il fondo del gel non si chiudesse bene, causando un un po' di dispersione di corrente che ti altera la corsa. prova a cambiare apparato e colora con comassie, non sbatterci la testa pił di tanto sul trasferimento, non č quello il problema

facci sapere.


...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Eleo
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia


89 Messaggi

Inserito il - 28 luglio 2008 : 23:44:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eleo Invia a Eleo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la penso come iside...penso proprio sia un problema di camera.
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chick80
Moderatore

DNA

Cittą: Edinburgh


11378 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2008 : 09:13:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se il voltaggio č troppo alto il gel si puņ surriscaldare, le maglie si allargano e le bande sbavano.

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fede.84
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:15:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fede.84 Invia a fede.84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eccomi qua! I western che ho fatto ieri e oggi erano perfetti! Di nuovo ho rifatto il laemly che era vecchissimo e ho fatto il blot di tre ore anzichč overnight! Il gel l'ho corso a 150V e 25mA...
Dite che possa essere una di queste cose?
La camera non ho potuto cambiarla, era l'unica che avevo!!
grazie comunque dei vostri consigli!!
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fede.84
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:22:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fede.84 Invia a fede.84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sģ, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!!
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valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2008 : 19:56:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da fede.84

Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sģ, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!!



Se usi la funzione "cerca" con un po' di pazienza trovi una discussione in cui se n'č gią parlato.

Io li avvolgo in carta bagnata + carta stagnola e li conservo a 4 gradi fino a 5 giorni!

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Utente Junior



527 Messaggi

Inserito il - 08 agosto 2008 : 11:36:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lą Invia a lą un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io di solito colo solo il lower e sopra ci metto l'acqua.
poi lo metto a 4°C, e quando mi serve ci colo sopra l'upper
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato

stitch

Cittą: Lausanne


12 Messaggi

Inserito il - 08 agosto 2008 : 15:49:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di swiss_redfox Invia a swiss_redfox un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da fede.84

Dimenticavo! Qualcuno di voi prepara mai i gel prima? Se sģ, come li si conserva? e per quanti giorni al massimo? grazie!!



preparo separating e stacking, impacchetto in carta bagnata con acqua e pellicola di plastica e lascio a 4°C x max 7gg. Alcuni miei colleghi tolgono addirittura gią il pettine e apparentamente i pozzetti si mantengono "in forma" senza problemi!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Cittą: Milano


7930 Messaggi

Inserito il - 08 agosto 2008 : 19:53:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Visto che c'č gią una discussione sulla conservazione dei gel che ne dite se continuiamo di lą?

http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=8616

Giusto per non creare doppioni!

GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

BUONA REGOLA DEL FORUM: prima di postare qualunque cosa leggere il Regolamento!
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Deimos
Nuovo Arrivato

0611_da_minodip

Prov.: Pavia
Cittą: Pavia


2 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2008 : 16:25:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Deimos Invia a Deimos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche secondo me il problema era nel voltaggio troppo elevato e relativo surriscaldamento. Io personalmete vado ad amperaggio costante aumentoandolo progressivamente una volta superato lo Stack fino ad un massimo di 30mA. Il tempo dipende dalla concentrazione della Poliacrilamide ma generalmente non pił di un'ora e mezza.
Saluti

Deimos the Western Magician
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