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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
 Inserito il - 31 luglio 2008 : 12:13:22
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Ciao...dopo aver immunoprecipitato la proteina d'interesse che sto studiando, ho fatto un western con anticorpo anti-ubiquitina per vedere se è ubiquitinata.Mi aspettavo di vedere una banda in corrispondenza della proteina, invece vedo uno smear sebbene ho immunoprecipitato la proteina (ho controllato se l'IP fosse venuta bene ed è perfetta)...qualcuno di voi ha già fatto esperimenti del genere e sa darmi qualche consiglio su come interpretare lo smear? ciao ciao
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liven
Nuovo Arrivato
Città: Roma
15 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2008 : 13:31:32
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ciao paolo, se con l'anticorpo anti ubiquitina vedi lo smear a PM maggiori di quello della tua proteina l'esperimento è riuscito perfettamente.
Lo smear è dovuto alla presenza di più forme di ubiquitinazione della tua proteina non ancora degradata. questi polimeri di ubiquitina aumentano il PM della tua proteina, dato che nel tuo campione la proteina viene ubiquitinata da polomeri di diversa lunghezza , tu vedi molte bande e molto vicine, in altre parole uno smear.
spero di esserti stato di aiuto.
Liven
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Messaggio inserito da paolo865
Ciao...dopo aver immunoprecipitato la proteina d'interesse che sto studiando, ho fatto un western con anticorpo anti-ubiquitina per vedere se è ubiquitinata.Mi aspettavo di vedere una banda in corrispondenza della proteina, invece vedo uno smear sebbene ho immunoprecipitato la proteina (ho controllato se l'IP fosse venuta bene ed è perfetta)...qualcuno di voi ha già fatto esperimenti del genere e sa darmi qualche consiglio su come interpretare lo smear? ciao ciao
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Liven
"Pillola azzurra, fine della storia: domani ti sveglierai in camera tua e crederai a quello che vorrai. Pillola rossa: resti nel paese delle meraviglie e vedrai quant’ é profonda la tana del bianconiglio…" |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
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262 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2008 : 20:28:17
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| grazie liven, però ho un'altro dubbio: facendo poi il western con l'anticorpo diretto contro la mia proteina d'interesse immunoprecipitata vedo solo una banda...perchè? |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2008 : 20:34:04
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| dimenticavo di dire che sto usando un anticorpo che riconosce proteine mono e poli ubiquitinate. se uso un anticorpo che riconosce sonlo proteine mono ubiquitinate cosa succede? |
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liven
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Inserito il - 01 agosto 2008 : 11:50:52
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....se usi un Ab contoro la forma mono-ubiquitinata, generalmente e sottolineo generalmente, vedi una sola banda. La presenza di più bande viene considerata aspecifico(crossreattività).
Da un punto di vista biologico le due modifiche hanno conseguenze molto diverse: la poli-ubiquitinizzazione (poly-Ub) è una modificazione associata alla degradazione via proteasomi, mentre la mono-ubiquitinizzazione (mono-Ub) è associata a diverse altre funzioni cellulari indipendenti dal proteosoma incluso il trafficking intacellulare, modificazioni istoniche, e DNA repair.
Saluti
Citazione:
Messaggio inserito da paolo865
dimenticavo di dire che sto usando un anticorpo che riconosce proteine mono e poli ubiquitinate. se uso un anticorpo che riconosce sonlo proteine mono ubiquitinate cosa succede?
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Liven
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liven
Nuovo Arrivato
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15 Messaggi |
Inserito il - 01 agosto 2008 : 11:56:21
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Ciao Paolo, scusami ma non avevo capito che con il tuo anticorpo anti-"tua proteina" hai visto una sola bansa.
Molto strano e di non facile interpretazione. Se mi scrivi il protocollo esatto che hai usato forse, ma sottolineo forse, posso aiutarti.
Citazione:
Messaggio inserito da paolo865
grazie liven, però ho un'altro dubbio: facendo poi il western con l'anticorpo diretto contro la mia proteina d'interesse immunoprecipitata vedo solo una banda...perchè?
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Liven
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
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262 Messaggi |
Inserito il - 01 agosto 2008 : 22:51:17
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allora provo a descriverti in breve quello che ho fatto.
Ho trattato le cellule trafettate con la mia proteina (chiamiamola X) con MG132 (inibitore del proteasoma) per 0-6h, poi ho lisati e recuperato l'estratto totale. In seguito ho immunoprecipitato la proteina X con resina flag e quindi caricato sul gel gli immunoprecipitati corrispondenti alle 0-6 ore del trattamento, i rispettivi Input e Output, e dopo il trasferimento su gel ho fatto il western con anti-ubiquitina. Il risultato è che nelle lane corrispondenti all'immunoprecipita, mi si forma uno smear verso l'alto.
In seguito ho blottato lo stesso filtro con l'anticorpo anti-X e mi vede solo una banda corrispondente alla proteina X. tutto qui..spero di essere stato chiaro e sintetico..grazie comunque per l'aiuto |
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lunissima
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Prov.: Roma
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6 Messaggi |
Inserito il - 01 agosto 2008 : 23:21:16
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LO Smear non potrebbe essere dovuto ad aspecifico che si lega alla resina? Questo spiega perchè con il blot anti ubiquitina vedi lo smear (dovuto ad aspecifico di diverso peso molecolare) che invece non vedi andando con l'Ab anti-X!!!Questo però lo capisci se hai anche le cellule non trasfettate, dato che se è aspecifico dovrebbe comparire cmq!
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
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262 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2008 : 10:05:08
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| la resina flag non è il massimo però in questo caso l'ip è venuta molto bene...non so |
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liven
Nuovo Arrivato
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15 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2008 : 19:58:48
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dunque, se non ho capito male hai trasfettato le tue cellule con la proteinaX taggata flag, hai fatto un time-course 0-6h con un'unica concentrazione di MG132 (spero che tu abbia fatto anche lo stesso con le cellule non-trasfettate), hai lisato le cellule e immunoprecipitato con resina-Ab anti-flag.Infine hai fatto un WB contro proteinaX e un WB contro ubiquitina.
Risultato: smear per anti-ubiquitina e una sola banda per proteinaX
Prima domanda: nelle cellule non trasfettate vedi lo smear?
Seconda domanda: da 0 a 6h, lo smear aumenta?
Terza domanda: nelle cellule trasfettate ma senza MG132 vedi lo smear?
quarta domanda: hai usato un anticorpo anti-flag per vedere se osservi ancora lo smear?
La risposta al tuo problema la troverai rispondendo a queste domande.
Se non hai fatto i ctrl di cui sopra è difficile dire qualcosa.
Spero di esserti stato di aiuto.
Citazione:
Messaggio inserito da paolo865
allora provo a descriverti in breve quello che ho fatto.
Ho trattato le cellule trafettate con la mia proteina (chiamiamola X) con MG132 (inibitore del proteasoma) per 0-6h, poi ho lisati e recuperato l'estratto totale. In seguito ho immunoprecipitato la proteina X con resina flag e quindi caricato sul gel gli immunoprecipitati corrispondenti alle 0-6 ore del trattamento, i rispettivi Input e Output, e dopo il trasferimento su gel ho fatto il western con anti-ubiquitina. Il risultato è che nelle lane corrispondenti all'immunoprecipita, mi si forma uno smear verso l'alto.
In seguito ho blottato lo stesso filtro con l'anticorpo anti-X e mi vede solo una banda corrispondente alla proteina X. tutto qui..spero di essere stato chiaro e sintetico..grazie comunque per l'aiuto
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Liven
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paolo865
Utente Junior
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Inserito il - 04 agosto 2008 : 23:37:50
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1)vedo lo smear anche nelle nn trasfettate, e aumenta con il trattamento per 6h con mg132
2)nelle cellule trasfettate e senza mg132 vedo uno smear ma molto minore
3)non ho provato con un anticorpo anti.flag...ci provo--grazie mille |
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liven
Nuovo Arrivato
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15 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2008 : 15:28:06
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ok, a questo punto se anche con l'anti flag vedi una sola banda, così come l'hai vista con l'anti-proteinaX, significa che la tua proteinaX non è ubiquitinata.
Aggiungo, ma questa è solo una speculazione, che se in letteratura è noto che la proteina è degradata via proteasomi, il tag flag ne potrebbe inpedire la ubiquitinazione.
Altrimenti potrebbe essere degradata via altri sistemi per es. i sistemi calpainici, proteasi libere, caspasi, ecc. ecc.
Citazione:
Messaggio inserito da paolo865
1)vedo lo smear anche nelle nn trasfettate, e aumenta con il trattamento per 6h con mg132
2)nelle cellule trasfettate e senza mg132 vedo uno smear ma molto minore
3)non ho provato con un anticorpo anti.flag...ci provo--grazie mille
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Liven
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Western anti-ubiquitina
Didattica e Relazioni
