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 Primer degenerati....why smear?
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paolaberna
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Inserito il - 04 agosto 2008 : 16:41:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolaberna Invia a paolaberna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti....
sono due settimane che provo continuamente ma il problema persiste.
Devo amplificare un gene a partire da CDNA...ho designato 3 coppie di primer degenerati a partire da sequenze note e conservate di amminoacidi...ma quando faccio la PCR vedo sempre (con tutte e tre le coppie di primer) uno smear all'inizio del pozzetto...(come se fosse qualcosa di molto grosso che non corre e rimane in parte nel pozzetto). Le volte che Ŕ andato meglio ho visto anche lieve la mai banda di intaresse...ho provato di tutto...ho variato la t di annealing, il buffer, ho rifatto il cDNA...sempre lo stesso smear!
(N.B. nei controlli negativi senza CDNA non ho lo smear). Qualcuno ha qualche idea di cosa possa essere?
e di come risdolvere questo problema...dovrei proseguire con il clonaggio e poi il sequanziamemto del gene ma mi sembra inutile visto che il gel Ŕ cosi sporco...
Grazie a tutti
paola
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