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d.goldy
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39 Messaggi

Inserito il - 08 agosto 2008 : 19:23:10

Ciao a tutti!
Chiedo aiuto a chiunque abbia un minimo di idea di come si inizia un esperimento. (:confused)
Io sono al primo anno di un dottorato e come tanti sto brancolando nel buio.javascript:insertsmilie('

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Sto facendo dual light luciferase assay su HEK 293 co-transfettate con 3 plasmidi: Luciferasi, normalizzatore(� galactosidase)e il plasmide che porta la sequenza che interagir� nella regolazione della luciferasi(miRNA)
Leggendo gli articoli mi sembrava una tecnica semplice e che funzionava sempre, ma da quando l'ho messa in pratica non riesco ad avere dati decenti (hanno ordini di grandezza diversi ogni volta), inoltre co transfetto con 3 plasmidi che secondo me competono tra loro nonostante abbiano lo stesso promotore.
Fino ad ora ho fatto quel che il mio relatore mi consigliava: stare in lab il pi� possibile provando un sacco di transfezioni e assay.

Ora vi dico quel che ho fatto cos� se qualcuno ha voglia di darmi qualche consiglio pu� riconosce i miei errori:

Prima ho provato a vedere se i plasmidi con il gene della luc e � gal funzionavano e venivano transfettati in hek cells, ne ho fatto l'assay e mi ha dato valori nell'ordine del milione. Cos� ho pensato di poter andare avanti.

Ho transfettato con
1. Luciferasi/inserto+ normalizzatore + microRNA
2. Luciferasi/inserto+ normalizzatore+ plasmide senza miRNA (controllo)
3. Luciferasi+ normalizzatore
4.Luciferasi senza inserto+ normalizzatore+ plasmide senza miRNA
5.Luciferasi senza inserto+ normalizzatore+ miRNA

I Dati variano ordine di grandezza ogni giorno che transfetto rimanendo per� quasi sempre costante che il 3. campione � pi� grande del 5. che � pi� grande del 2. ma da un giorno all'altro posso avere ordini di grandezza diversi. Per esempio: 3. Luc + norm pu� essere 1 milione un giorno e un altro 100'000, il 2. sar� 100'000 quando l'altro(3.) era 1 milione e 1'000 quando il 3. 100'000.
Voi mi direte che � per questo che si usa il normalizzatore, ma sfortunatamente anche i rapporti tra luc e normalizzatore non hanno lo stesso ordine di grandezza!
Come si fa di solito in questi casi? quali sono secondo voi i passaggi da fare ed � normale che le transfezioni varino cos� tanto?

Il mio capo mi ha fatto fare la curva standard per luciferasi e � galacosidase, mi sono venute bruttissime, ma lui dice che vanno bene e che il range di linearit� (che passa tra 2 punti!!!!) � quello in cui i 2 valori dell'assay devono cadere.(non ci riesco)
Secondo voi � utile se non devo quantificare?

Come se non bastasse io lavoro in un lab di fisiologia e sia il mio capo sia gli altri phd e postdoc non se ne intendono di LUC assay.
Mi potete dare qualche consiglio o magari qualche link che mi possa chiarire un po' le idee su cosa si fa quando si inizia un esperimento del genere.
Grazie a tutti sin da ora