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zerhos
Utente Junior

ZERHOS
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Inserito il - 21 agosto 2008 : 01:58:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
vorrei qualche informazione sulle modalità di approccio per lo studio delle sinapsi o della corteccia cerebrale
senza tanti ghirigori,della serie quale sono le tecniche usate e cosa mi consente di vedere/capire quella tecnica.

ad esempio che diff passa nell usare antagonisti per i canali voltaggio dipendente responsabili dei pde
e antagonisti per i recettori post sinaptici?
COSE DI QUESTO GENERE
grazie.

"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11374 Messaggi

Inserito il - 21 agosto 2008 : 08:44:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmmm dovresti essere un po' più specifico. E' come se ti chiedessi: come si studia il DNA? Capisci che può essere un pochino vago... :)

Ad esempio, le tecniche sono diverse se stai studiando il cervello di un uomo (che generalmente vuoi tenere intero) o il cervello di un topo (che magari puoi fare a fettine, permettendoti di usare tecniche diverse).

Visto che parli di studi con agonisti/antagonisti immagino tu stia parlando di fettine di cervello.
Conta che poi queste tecniche sono le stesse per qualsiasi area del cervello tu voglia analizzare. La corteccia ha il vantaggio che permette di fare anche misure in-vivo dell'attività di singole cellule, cosa molto più complessa (anche se possibile) con le aree più interne.

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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


419 Messaggi

Inserito il - 21 agosto 2008 : 13:28:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si lo so la domanda è un po vaga
il fatto è che se volessi studiare qualcosa inerente al dna,saprei in linea teorica cosa fare,ad esempio saprei estrarlo,separarlo,individuare sequenze specifiche,studirne le sequenze promotrici,analizzare le interazioni dna proteina ecc e tutto con varie tecniche diverse

di contro però se dovessi per qualche motivo fare uno studio sul cervello,magari so come funzionano le sinapsi,conosco l'attività cerebrale,o come vedono gli occhi,ma nn onosco nemmeno una tecnica e nn saprei quindi come muovermi.

quindi volevo un introduzione a le tecniche principali utilizzate in vitro e in vivo senza entrare nel dettaglio(quelli me li vado a vedere io una volta che conosco l'esistenza di una data tecnica) e cosa permettono di vedere/capire.

tipo
utilizzo di antagonisti vari,perchè?
colorazione con amminoacidi,perchè?
nmr,perchè?
spero di essere stato chiaro,forse sto chiedendo troppo?
magari linkatemi qualcosina in lingua italiana se possibile :D

"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11374 Messaggi

Inserito il - 21 agosto 2008 : 14:50:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, allora faccio un po' una generalizzazione che magari non è accuratissima (non me ne voglia nessuno).

Puoi analizzare l'attività cerebrale a più livelli.

A livello "globale" hai tutta la ricerca generalmente sull'uomo e sulle scimmie dove puoi fare esperimenti del tipo:
- quale parte del cervello viene attivata quando faccio xxxx?
- come viene processata un'immagine o un suono dal cervello?
- posso muovere questo braccio meccanico solo "col pensiero"?

In questi casi potrai usare tecniche quali l'imaging di risonanza magnetica funzionale (fMRI) o lo studio dell'elettroencefalogramma (EEG).
Ad esempio l'EEG valuta l'attività elettrica del cervello, come somma dell'attività elettrica delle singole cellule. Con analisi matematiche di deconvoluzione piuttosto complesse si possono anche distinguere diversi tipi di attività che generano la risposta finale. Questi dati possono essere usati per molti scopi, finanche alla creazione di interfacce uomo-computer.
Ne parlavo tempo fa qui: http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=24

In alcuni casi puoi anche fare interventi più invasivi (come nel link che ti ho messo sopra) e impiantare elettrodi direttamente nel cervello.

In questo caso vai quindi a valutare l'attività GLOBALE del cervello (o di una sua regione) e non l'attività del singolo neurone.

Questi esperimenti vengono anche spesso usati nei dipartimenti di psicologia, dove si fanno studi comportamentali. Questi li puoi fare indifferentemente sull'uomo o sugli animali (scimmie, topi, ratti, ma anche polipi, uccelli o api volendo!).
In questo caso le domande a cui vuoi rispondere sono più del tipo:
- quali sono gli effetti di questa sostanza o di questa malattia o di questo stato fisiologico (es. la gravidanza) sul comportamento?

Questi tipi di studi possono in generale utilizzare le tecniche di cui ti ho parlato sopra perchè ad es. puoi fare dei test funzionali con l'fMRI per vedere ad es. se certe aree sono più attive di altre nei soggetti di controllo rispetto a quelli trattati con una droga. Puoi anche fare studi comportamentali (es. water maze, T-maze etc) per valutare il livello di stress o la capacità di memorizzare eventi etc.
Ovviamente se lavori con topi o ratti puoi avere problemi tecnici a fare un fMRI, inoltre non possono darti descrizione della loro situazione come invece può fare un uomo.


Se stai usando animali puoi anche fare test a livello di singola cellula o di piccoli gruppi di cellule.
Questo lo puoi fare sia in vivo sia in vitro. Si tratta principalmente di fare esperimenti di imaging o di elettrofisiologia.
I test in vitro si fanno generalmente su fettine di cervello piuttosto spesse (150-200 micron) che vengono mantenute vive in soluzione fisiologica ossigenata.
Per quanto riguarda l'elettrofisiologia si fa ad es. patch-clamp in cui usi un microelettrodo per misurare l'attività elettrica di un singolo neurone.
L'imaging ti permette di vedere l'attività ionica della cellula. Ad es. calcium imaging per vedere come cambiano i livelli di calcio all'interno della cellula, piuttosto che chloride imaging per il cloro o addirittura voltage imaging che ti permette di "vedere" i cambiamenti di voltaggio senza usare elettrodi, ma usando sonde fluorescenti che cambiano fluorescenza a seconda del voltaggio.
Puoi inoltre fare analisi morfologiche della cellula riempiendola con un composto a basso peso molecolare e poi processando la fettina con immunoistochimica. Questo ti permette di visualizzare dettagli morfologici come le spine dendritiche.
Gli esperimenti di elettrofisiologia ti permettono anche di studiare le cinetiche di singoli canali ionici misurando le "single channel activity", cioè il passaggio di ioni attraverso un singolo canale ionico sulla cellula.

I test in vivo sono molto più complessi, ma le tecniche sono le stesse. Si può fare imaging in vivo e si può fare patch clamp in vivo (avendo mooooooooooooooooolta mooooooooolta pazienza).
Guarda ad es. http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=19

Ovviamente poi puoi sempre prendere un pezzo di cervello, estrarne DNA o proteine e fare tutta la biologia molecolare che vuoi!

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elly_
Utente Junior

brain blu



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Inserito il - 21 agosto 2008 : 16:27:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elly_ Invia a elly_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Col patch-clump si puo' andare ad analizzare sia l'attivita' elettrica della cellula, sia l'attivita' di singolo canale a seconda della configurazione adottata dalla pipetta-elettrodo.
Esistono inoltre le matrici di multielettrodi, che sono delle piastre di silicio su cui sono presenti molti elettrodi. Su queste piastre vengono fatte crescere cellule in coltura ed e' possibile misurare l'attivita' di rete.

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11374 Messaggi

Inserito il - 21 agosto 2008 : 17:15:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Esatto. Tra l'altro si può anche misurare l'attività di più cellule insieme con gli extracellular recordings. In pratica metti un elettrodo nel tessuto (nella matrice, non su una sola cellula) e misuri l'attività di tutto ciò che ci sta attorno!

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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


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Inserito il - 21 agosto 2008 : 20:55:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille,il fatto è che la fisiologia e soprattutto la neurofisiologia sn materie estremamente interessanti ma che secondo me nelle facoltà di biologia nn sn affrontate come si deve (nella triennale).
CMQ ora che ho un infarinata generale delle tecniche,vi sparo subito 2 domande mirate e molto interessanti.

I fattori neurotrofici, come Nerve Growth Factor (NGF) e BrainDerived Neurotrophic Factor (BDNF) sono una famiglia di proteine secrete che promuovono la
sopravvivenza neuronale legandosi ad appositi recettori sulle cellule bersaglio. In
un esperimento, i ricercatori trovano che neuroni del sistema nervoso centrale sopravvivono
in coltura se esposti a sufficienti concentrazioni di BDNF. Tuttavia, dopo
alcuni giorni gli stessi neuroni cominciano a morire nonostante si continui ad
aggiungere la stessa quantit`a di BDNF al mezzo di coltura.perchè?
nn so propio rispondere.

In un esperimento di elettrofisiologia, un ricercatore intende bloccare l’attivit`a
elettrica della corteccia cerebrale e si serve di due approcci sperimentali: a) iniezione
di tetrodotossina, bloccante dei canali sodio voltaggio-dipendenti coinvolti
nella genesi del potenziale d’azione; b) iniezione di antagonisti dei recettori
post-sinaptici per il glutammato. Discutere le differenze tra le due strategie
sperimentali.
qua io direi che entrambe le strategie portano al medesimo risultato cioè il blocco della genesi dei PDE,la TTX blocca i canali voltage dipendent del NA+ e quindi è chiaro,gli antagonisti dei recettori al glutammato non permettono il legame del neurotrasmettitore al recettore e quindi nn si genera il potenziale post-sinaptico,quindi niente correnti elettrotoniche che attivano l encoder del neurone post sinaptico. o c è da fare altre considerazioni?

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Salvador.Dalì
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chick80
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DNA

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Inserito il - 21 agosto 2008 : 21:59:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
I fattori neurotrofici, come Nerve Growth Factor (NGF) e BrainDerived Neurotrophic Factor (BDNF) sono una famiglia di proteine secrete che promuovono la
sopravvivenza neuronale legandosi ad appositi recettori sulle cellule bersaglio. In
un esperimento, i ricercatori trovano che neuroni del sistema nervoso centrale sopravvivono
in coltura se esposti a sufficienti concentrazioni di BDNF. Tuttavia, dopo
alcuni giorni gli stessi neuroni cominciano a morire nonostante si continui ad
aggiungere la stessa quantit`a di BDNF al mezzo di coltura.perchè?
nn so propio rispondere.


Potrebbe essere un problema di desensitizzazione del recettore. La cellula continua ad essere esposta allo stesso stimolo per molto tempo e piano piano lo prende per "normale", e comincia ad internalizzare i recettori per quello stimolo, rendendolo così meno efficace. Serve quindi una dose maggiore per ottenere lo stesso risultato.

Insomma, l'equivalente cellulare della tolleranza ad un farmaco dopo ripetuto uso.

----
Citazione:
In un esperimento di elettrofisiologia, un ricercatore intende bloccare l’attivit`a
elettrica della corteccia cerebrale e si serve di due approcci sperimentali: a) iniezione
di tetrodotossina, bloccante dei canali sodio voltaggio-dipendenti coinvolti
nella genesi del potenziale d’azione; b) iniezione di antagonisti dei recettori
post-sinaptici per il glutammato. Discutere le differenze tra le due strategie
sperimentali.

La tua considerazione è corretta, ma devi ricordarti che il glutamato non è l'unico neurotrasmettitore nel cervello. Bloccando i recettori del glutamato blocchi SOLO gli input glutamatergici ma non altri input (positivi o negativi che siano) e quindi non blocchi necessariamente tutti i potenziali d'azione (a proposito, cosa intendi con PDE, post-depolarization events o cosa?).
Inoltre, anche la tetrodotossina non ti garantisce il blocco completo della comunicazione neuronale in quanto esiste il cosiddetto "spillage" di neurotrasmettitore, per cui due neuroni possono comunicare tramite rilascio di neurotrasmettitore NON mediato da potenziali d'azione (lo accennavo qui http://www.molecularlab.it/insideneuroscience/?p=29 )

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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

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Inserito il - 21 agosto 2008 : 22:27:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per pde starebbe per pda potenziale d azione,ma mi so bsagliato a scriverli........:D
cmq si dello spillage avevo gia letto sul blog del sito,molto interessante.

ah un altra cosa:ho visto che per tracciare le connessioni nervose i dovrebbero usare amminoacidi che si muovono sfruttando il flusso assonico,è vera sta cosa o sto dicendo una boiata? se si come funzionerebbe la cosa?

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Salvador.Dalì
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chick80
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Inserito il - 22 agosto 2008 : 08:38:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il tracing si può fare in vari modi, ad es con DiI (1,1#8242;-Diethyl-2,2#8242;-dicarbocyanine iodide) o derivati.
In alternativa si possono usare tracers virali come varianti dello pseudorabies virus ( http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudorabies#Applications_in_Neuroscience ).
Degli aminoacidi proprio non saprei ma tutto è possibile!

Vedi anche:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=7466
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5055

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batsake89
Nuovo Arrivato

Prov.: bari
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Inserito il - 17 aprile 2013 : 00:01:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di batsake89 Invia a batsake89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A proposito della domanda sulla sopravvivenza dei neuroni in coltura, credo che la risposta sia nell'articolo che ti allego. In sintesi, i neuroni rispondono molto meglio alle neurotrofine se sono elettricamente attivi, ad esempio se scaricano pda con una frequenza non troppo ridotta, o se sono immersi in una soluzione extracellulare più ricca di Potassio del normale. Evidentemente i neuroni in coltura, forse per il fatto di essere distaccati l'uno dall'altro e di non avere connessioni sinaptiche, mantengono la loro attività elettrica a valori molto bassi, insufficienti a rispondere alle neurotrofine. Nell'articolo si dice che non è ancora noto il meccanismo molecolare attraverso cui l'attività elettrica influisce sulla responsività dei neuroni alle neurotrofine, ma personalmente ritengo che l'attività elettrica influisca sulla quantità di recettori per neurotrofine espressi dalle cellule. Ad esempio (ipotesi assolutamente personale), l'attività elettrica potrebbe causare la depolarizzazione frequente del neurone, l'apertura frequente di canali per il Calcio voltaggio-dipendenti, l'aumento periodico della concentrazione intracellulare di calcio e quindi l'aumento della probabilità di fusione delle vescicole contenenti i recettori per neurotrofine con la membrana.

Allegato: 1-s2.0-S0896627300802391-main.pdf
2526,67 KB
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