purificazione PCR x sequenziamento

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ElenaG
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2008 : 20:52:34

Ciao! Sto riscontrando problemi nel sequenziamento di alcuni esoni di un gene: sto purificando il prodotto di PCR utilizzando gli stessi primers che uso x la PCR, ma ogni volta ottengo sequenze tanto sporche da essere illeggibili. In alcuni casi dopo svariate ripetizioni ho notato che es. la sequenza forward e' sempre buona mentre la reverse e' sempre cattiva. Qualcuno ha idea di quale possa essere il problema? Puo' dipendere dal metodo di purificazione del prodotto di PCR? (finora ho purificato direttamente il prodotto, non dal gel). Grazie!

cin
Utente Junior

Prov.: Padova
Città: Padova

558 Messaggi

Inserito il - 28 agosto 2008 : 11:45:27

Sinceramente non capisco cosa intendi purificare il prodotto di pcr utilizzando dei primers, io purifico mediante enzimi (exosap) oppure delle colonnine della millipore. Se intendi dopo la purificazione, nella PCR di sequenza, allora prova a diluire ulteriormente i primers della prima PCR, anche a me succedeva una cosa simile e l'ho risolta così.

babilei
Nuovo Arrivato

10 Messaggi

Inserito il - 28 agosto 2008 : 15:21:33

Ciao
Non so se sul forum si possono caricare file ab1; se si, caricane alcuni sia for che rev, in modo che possa vedere di che tipo di "sporco" si tratta.
Direi però che se il for viene bene e il rev no, è probabilmente un problema del primer rev, non di purificazione.
Se vedi picchi netti ma sovrapposti, significa che la sequenza è doppia, cioè si è innescata in punti diversi.
Per darti un aiuto però devo vedere le sequenze.