topi KO condizionali e inducibili

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silvietta82
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 01 settembre 2008 : 12:31:11

Ciao a tutti, sono una studentessa di biologia e devo inventare una specie di miniprogetto (di fantasia ma che abbia un senso logico) su animali geneticamente modificati...sono bloccata all'ultimo punto e ho dubbi anche sul resto, cos� eccomi a chiedere il vostro aiuto! Riassumendo: ho ipotizzato di identificare una nuova neurotrofina omologa di BDNF e le ho dato lo pseudonimo NNT e ho ipotizzat di trovare l'ATG nell'esone2.
Ho fatto il costrutto: reg.omologa-esone1-loxP-neo-loxP-esone2-loxP-esone3-reg.omologa-TK
L'ho trasfettato nelle ESC e ho fatto la selezione co G418 e ganciclovir
ho eseguito una trasfezione transiente con un costrutto di CRE per eliminare NEO nei ricobinanti(e ho fatto screening con Sothern Blot)quindi ho ottenuto un allele floxed
Ho iniettato le ESC mut in blastocisti di topo albino e impiantato la blastocisti in topo pseudogravida per lo sviluppo dei topi chimera
Ho incrociato un topo chimera con un omozigote albino per ottenere topi eterozigoti neri NNT-wt/flox e incrociando due di questi l'omozigote NNT-flox/flox (con due alleli: exo1-loxP-exo2-loxP-exo3).
Poi ho incrociato gli omozigoti NNT-flox/flox con topi esprimenti CRE sotto il controllo di un promotore inducibile da un Transattivatore doxociclina-dipendente e la trascrizione del transattivatore � sotto il controllo di un promotore specifico per il Sistema Nervoso Centrale. In questo modo dovrei poter eliminare l'esone 2 in un momento preciso dello sviluppo e solo nel SNC (non nel periferico).
Ora vorrei vedere come questa delezione incide negativamente sulla migrazione dei neuroblasti dal sistema subventricolare al bulbo olfattivo...

cosa posso fane dei topi creati? Che tipo di esperimenti potrei ipotizzare di fare? Ha senso quello che ho scritto
Vi ringrazio anticipatamente
Silvia

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 01 settembre 2008 : 15:09:28

Una cosa volevo domandarti: per ottenere i topi CRE-inducibili hai pensato
a qualche cosa particolare? cio�, dovresti avere incrociato topi che
esprimono il tTA da un promotore del SNC con topi knock-in per un
costrutto PCMV-CRE , ad esempio. O una cosa simile.

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

silvietta82
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 01 settembre 2008 : 15:26:33

Si, esatto, per� non ho approfondito il discorso per non complicare troppo il progetto..forse � il caso che lo faccia! Ma ora che ho questi topi che tipo di esperimenti potrei farci per valutare la migrazione? Io pensavo prove di migrazione (es Boyden) usando cellule tratte da questi animali..ma non so! Se ti viene in mente qualcosa, qualsiasi suggerimento � ben accetto!! Grazie per aver risposto!