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CRISTIAN
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92 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:16:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Dovrei clonare due geni in un unico vettore per produrre due proteine ricombinanti fuse assieme in E coli, qualcuno ha qualche consiglio di quale vettore usare o con quale sistema?
Ho sentito l'invitrogen che propone il Gateway ma mi sembra un pò costoso..anche perchè devo solamente clonarlo in un vettore di espressione procariotico.
Qualcuno ha qualche consiglio o qualche alternativa?
Di un gene ho già la sequenza di cDNA, l'altro gene è la mu chain delle IgM human, però ho difficoltà a trovare l'mRNA, qualcuno ha a disposizione o conosce la sequenza di µ chain human mRNA?
Grazie infinite

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:24:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io ho trovato molto comodo il sistema pET
per clonare in cellule BL21 di E. Coli.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:31:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Certo, anch'io ho usato il sistema pET, ma ti permette di clonare due geni unendoli mediante un tag?
come posso fare?
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:46:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse potresti fondere i due ampliconi in vitro, usando un linker.
Tipo: disegni due primers in parte complementari al linker e in parte
complementari alle due estremità e li usi per creare un amplicone unico.

So che questo metodo si usa con i SCFV (single-chain fragment variable)
per farci phage display e penso non sia dissimile da quello che vuoi ottenere,
visto che se ho capito bene stai clonando catene anticorpali.


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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:50:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un gene è la catena u chain delle IgM (a proposito qualcuno riesce a trovare l'mRNA??), l'altro gene è semplicemente una citochina.
Io preferivo "fondere" i due geni direttamente nel vettore, qualche alternativa al gateway? si possono fondere direttamente nel pET?
Grazie
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morgan79
Utente Junior

insuperabile

Prov.: Bari


143 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2008 : 15:34:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di morgan79  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di morgan79 Invia a morgan79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io farei un doppio clonaggio, se non ho capito male vuou clonare e far esprimere la u chain come proteina di fusione; in tal caso clonerei prima la citochina priva del codone di stop e nel primer reverse con cui amplifichi la citochina al 5' ci metti due siti di restrizione (diversi da quelli del polylinker naturalmente) per clonarci in seguito la u chain. in questo modo si perde tempo ma hai una buona percentuale di successo

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare
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