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d.goldy
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 Inserito il - 21 settembre 2008 : 20:56:17
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Ciao a tutti,
qualcuno ha idea della ragione per cui se transfetti 3 plasmidi con lo stesso promotore, i 3 competeranno per la traduzione delle loro proteine e la quantitá di una delle proteina sará maggiore rispetto alle altre 2?
Trovo che sia un quesito interessante ma nessuno mi ha ancora risposto 
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 00:09:20
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Citazione:
Messaggio inserito da d.goldy
Ciao a tutti,
qualcuno ha idea della ragione per cui se transfetti 3 plasmidi con lo stesso promotore, i 3 competeranno per la traduzione delle loro proteine e la quantitá di una delle proteina sará maggiore rispetto alle altre 2?
Trovo che sia un quesito interessante ma nessuno mi ha ancora risposto
Il motivo è semplice ed intuitivo. I promotori utilizzati nei plasmidi sono quasi sempre dei promotori di origine virale e comunque molto forti, tali da saturare quasi il sistema di traduzione proteica della cellula ospite. Quando fasi una trasfezione, in genere inserisci circa una 50ina di copie del vettore, quindi il sistema è praticamente saturo. Se metti tre vettori in una trasfezione, non riusciresti mai ad avere una perfetta suddivisione dei plasmidi, basta che uno dei tre, o anche 2 siano in maggioranza per saturare la cellula e non permettere al plasmide meno rappresentato di esprimere una quantità significativa di proteine.
In definitiva, se transfetti 3 vettori con un rapporto di 5:4:3, l'espressione che ne risulta non sarà proporzionato, ma sarà del tipo 70%:29%:1% per il fenomeno della saturazione.
Per aggirare il problema si fanno delle espressioni stabili.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 01:37:16
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Beh una cinquantina di copie mi sembra eccessivo, ma su tutto il resto del discorso sono d'accordo.
Per aggirare il problema direi che l'espressione stabile è strumentale all'ottenimento di
almeno un clone cellulare in cui l'espressione coordinata dei tre plasmidi sia bilanciata,
in virtù di una fortuna integrazione genomica e un fortunato dosaggio reciproco dei vettori.
Ottenerlo da una co-transfezione sarebbe ovviamente azzardato: bisognerebbe effettuare tre
cicli di transfezione stabile e selezionare di volta in volta i cloni 'fortunati'.
Se invece non occorre una contemporanea espressione dei 3 plasmidi, un'ottima soluzione per
evitare la competizione reciproca potrebbe essere rappresentata da sistemi ad espressione
diversamente inducibile (un plasmide doxiciclina, uno ecdisone, uno Lac, ecc.).
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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d.goldy
Nuovo Arrivato
39 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 09:47:05
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Grazie mille per l'aiuto!!!
cosa si intende per sistemi ad espressione diversamente inducibile?
Inoltre sembrerebbe impossibile trasfettare 3 plasmidi ed avere una buona riproducibilità???
Io devo transfettare 3 plasmidi per un dual light assay,più di una persona l'ha fatto, ma non io.
Ho pensato che ci fosse una ragione che una grande azienda mettesse in commercio 2 reporter plasmids con lo stesso promotore, ma pare sia una cavolata....
Non so più che pesci pigliare!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 14:36:09
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Citazione:
Messaggio inserito da d.goldy
Grazie mille per l'aiuto!!!
cosa si intende per sistemi ad espressione diversamente inducibile?
Inoltre sembrerebbe impossibile trasfettare 3 plasmidi ed avere una buona riproducibilità???
Io devo transfettare 3 plasmidi per un dual light assay,più di una persona l'ha fatto, ma non io.
Ho pensato che ci fosse una ragione che una grande azienda mettesse in commercio 2 reporter plasmids con lo stesso promotore, ma pare sia una cavolata....
Non so più che pesci pigliare!
La trasfezione tripla stabile non l'ho mai sentita e non credo sia attuabile per diverse difficoltà tecniche come l'uso di tre antibiotici diversi, tre markers e una bassissima probabilità di avere una cellula con tre buone integrazioni. Quindi siamo daccordo sul fatto che non è praticabile.
Per la luciferasi fare un triplo stabile a step sarebbe fuori luogo, ci metteresti diversi mesi ed inutilmente.
I vettori per il saggio della luciferasi, infatti, sono fatti in modo da evitare la problematica della saturazione, le ditte consigliano i vettori da trasfettare, in quale quantità etc... quindi non ci sono di questi problemi.
Comunque sia c'è sempre un po' di variabilità dovuta alla trasfezione, tuttavia considera che il saggio non si fa su singola cellula, ma su una popolazione, per cui l'errore dovuta ad un diverso rapporto dell'espressione dai diversi vettori è minimizzato in qualche modo.
I sistemi inducibili sono dei sistemi che ci danno la possibilità di controllare l'espressione del gene attraverso delle sostanze che aggiungiamo noi dall'esterno. Es: trasfetto un vettore inducibile con il gene X e questo non è espresso finché nella soluzione delle cellule non aggiungo la sostanza S.
Probabilmente Dionysos consigliava di usare tre modi diversi per indurre l'espressione delle 3 proteine in modo tale da non esprimerle contemporaneamente e quindi evitare la competizione.
@Dionysos, per il numero di plasmidi, è vero mi sono un po' buttato, l'ho sentito una volta in un seminario, ovviamente dipende dal sistema di trasfezione, dalle cellule e dalla grandezza del vettore, ma tutto sommato se in un batterio ce ne possono essere 50-100 (High copy plasmid), penso che non sia eccessivo per una cellula eucariotica 50 copie, ma comunque sarei curioso di sapere il range numerico reale.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 19:07:15
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Citazione:
Probabilmente Dionysos consigliava di usare tre modi diversi per indurre l'espressione delle 3 proteine in modo tale da non esprimerle contemporaneamente e quindi evitare la competizione.
Sì esatto.
Citazione:
Dionysos, per il numero di plasmidi, è vero mi sono un po' buttato, l'ho sentito una volta in un seminario, ovviamente dipende dal sistema di trasfezione, dalle cellule e dalla grandezza del vettore, ma tutto sommato se in un batterio ce ne possono essere 50-100 (High copy plasmid), penso che non sia eccessivo per una cellula eucariotica 50 copie, ma comunque sarei curioso di sapere il range numerico reale.
Il range non lo conosco, ho solo sentito ad una lezione di biologia molecolare che
in genere si può arrivare a tre-quattro copie, in quanto il materiale episomale
"infastidisce" le cellule eucariotiche, e quindi è tutta una lotta con le nucleasi
che esercitano una pressione non indifferente. Immagino, per pura presunzione,
che il range sia variabile a seconda del tipo cellulare. Nei batteri invece è fisiologica la
presenza di almeno una decina di elementi extracromosomali, anche perchè repliconi
(mentre negli eucarioti, in genere, non lo sono - fatto salvo per i genomi virali erpetici) |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2008 : 00:39:38
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Sinceramente dubito fortemente che le copie plasmidiche possano essere dell'ordine di 3-4 per cellula in seguito ad una transfezione transiente. Lo penso in base al fatto che un plasmide non esageratamente grande può integrarsi in una micella di agente transfettante in molte copie e poi ogni cellula riceve diverse micelle.
Per esperienza so che una transfezione transiente ha un picco di espressione proteica che è centinaia di volte più intensa rispetto alla stessa cellula quando è transfettata stabilmente con lo stesso plasmide, e poi se segui l'EGFP dopo una transfezione e si può vedere una riduzione graduale della fluorescenza, cosa difficile con solo 3-4 plasmidi
poi non so 
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2008 : 09:01:41
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Citazione:
Sinceramente dubito fortemente che le copie plasmidiche possano essere dell'ordine di 3-4 per cellula in seguito ad una transfezione transiente. Lo penso in base al fatto che un plasmide non esageratamente grande può integrarsi in una micella di agente transfettante in molte copie e poi ogni cellula riceve diverse micelle.
Come ti ho detto ciò che viene somministrato non è uguale a ciò che è effettivamente integrato,
perchè tra il dire e il fare ci sono in mezzo nucleasi, ricombinasi, ecc (per non parlare dei sistemi
antivirali). Si tratta di variabili farmacocinetiche che noi possiamo trascurare - per saggi cellulari-
ma in gene therapy se ne tiene parecchio conto, perchè riducono notevolmente la disponibilità.
Significa che tu puoi consegnare alla cellula anche 100 plasmidi, ma quanti raggiungeranno
il nucleo e avranno il tempo di reclutare l'apparato trascrizionale prima di venire spezzati,
ricombinati, degradati è una questione statisticamente sfavorevole, perchè non avendo sistemi
di protezione (che invece i virus hanno) devono sopportare pressioni non indifferenti a favore
della loro distruzione. Credo che in una qualsiasi review di gene therapy /drug delivery si parli
di queste cose in modo matematicamente approfondito. Io ne conosco solo i dettagli teorici.
Il professore che diceva 3-4 copie non era un abitante di cattedre, ma piuttosto uno che si era
occupato di ricerca per anni e che tutt'ora sta in laboratorio. Credo solo abbia avuto le sue ragioni.
Citazione:
Per esperienza so che una transfezione transiente ha un picco di espressione proteica che è centinaia di volte più intensa rispetto alla stessa cellula quando è transfettata stabilmente con lo stesso plasmide, e poi se segui l'EGFP dopo una transfezione e si può vedere una riduzione graduale della fluorescenza, cosa difficile con solo 3-4 plasmidi
Per mia esperienza.... mi risulta esattamente l'opposto
Nei cloni stabili è comune trovare livelli di espressione anche di 200-300 volte le non transfettate,
valore che non dipende linearmente dalla quantità di templato, ma da variabili molto più importanti
come il punto d'integrazione nel genoma (stato della cromatina, presenza di enhancers, ecc.).
Dubito che senza un sistema di transfezione efficientissimo (ben oltre la lipofezione)
si possa riuscire a fare di meglio in transiente, considerato che la transiente è una
miscela di cellule transfettate con diversissima efficienza, tra cui ci sono cellule
che non hanno integrato nulla e cellule che hanno integrato molto. Io con il FuGENE,
che è un transfettante lipidico, ho ottenuto al massimo massimo un valore globale di
50 volte rispetto alle NT (globale nel senso che è una somma algebrica di più valori).
Comunque non posso sapere a cosa corrisponde in termini di templato, o almeno, non per
corrispondenza matematica: per saperlo si dovrebbe dosare direttamente il DNA, non i livelli
di espressione, che sono comunque una manifestazione secondaria in cui partecipano
in modo non trascurabile promotore, RBS, fattori i trans e una miriade di altre variabili,
(praticamente tutte tranne quella dell'integrazione che dicevo sopra) tali da rendere
l'espressione più che proporzionale al templato. O anche meno che proporzionale,
ad esempio se consideriamo il discorso della competizione di questo topic.
Insomma una stima del templato per valutazione dell'espressione potrebbe non avere
nulla a che vedere con la realtà, per cui non è assolutamente utilizzabile, salvo utilizzo
di sistemi standardizzati di riferimento (cioè in cui un 'tot' di fluorescenza, ad es. di GFP,
corrisponde a 'tot' templato, validato per dosaggio diretto delle copie).
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2008 : 19:39:56
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Citazione:
Citazione:
Per esperienza so che una transfezione transiente ha un picco di espressione proteica che è centinaia di volte più intensa rispetto alla stessa cellula quando è transfettata stabilmente con lo stesso plasmide, e poi se segui l'EGFP dopo una transfezione e si può vedere una riduzione graduale della fluorescenza, cosa difficile con solo 3-4 plasmidi
Per mia esperienza.... mi risulta esattamente l'opposto
Nei cloni stabili è comune trovare livelli di espressione anche di 200-300 volte le non transfettate [...]
Uhmm... sommariamente sono daccordo, tuttavia forse tu stai trattando la cosa come popolazione cellulare, mentre io traggo conclusioni su singole cellule trasfettate. Es registrazioni di correnti di un particolare canale ionico su singola cellula, oppure la fluorescenza dell'EGFP etc etc. Se queste cose le fai trasfettate in transiente ed in stabile ti accorgi dell'enorme differenza di espressione.
Su una popolazione cellulare è chiaro che la somma del prodotto genico di uno stabile è superiore alla somma di un prodotto genico transiente, ma solo perché ci sono più cellule trasfettate. Prese le cellule singolarmente è esperienza comune che le quelle trasfettate transientemente (quindi non comprensive di quelle in cui la trasfezione non è avvenuta) esprimono molto di più rispetto alle stabili.
Questo thread, infatti, è nato proprio sulla competitività tra le trasfezioni stabili in quanto saturano il sistema di traduzione proteica. Le cellule stabili di certo non hanno problemi di saturazione ed in qualche caso, come nel mio, bisogna aiuare le cellule con una trasfezione transiente per esprimere di più la proteina oppure generare un vettore che contenga più copie del gene per dare una espressione basale più forte nelle stabili.
Detto questo, speravo che qualcuno intervenisse con un articolo ad hoc sull'argomento e svelasse il range realmente misurato; sarei veramente molto sorpreso se scoprissi che ci sono <10 copie di plasmidi per cellula.
Con questo penso di aver esaurito l'argomentazione 
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2008 : 20:15:19
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Se troverò l'articolo, sicuramente lo posterò.
Ora non ce l'ho.
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competizione tra plasmidi
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